一、免疫金染色
（一)免疫金法（IGS)
1987年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的免疫金法（Immunogold staining, IGS)。IGS的特点是染色程序简便，不要显色，就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20nm，并且用的浓度较高。用IGS定位细胞抗原时一般都采用间接法，下面以人肝组织HBsAg的定位为例说明IGS的步骤：
（1)石蜡切片→脱蜡至水。
（2)0.1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
（3)用双蒸水振洗5＇×2。
（4)用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（5)1%卵蛋白（EA)封闭10min。
（6)稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体（用0.02mol/l TBS pH8.2 作1：100稀释)，4℃过夜。
（7)0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（8)1%EA封闭10min。
（9)0.02mol/l TBS pH8.2 稀释兔抗鼠金标抗体（1：8)37℃45min。
（10)0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（11)双蒸水振洗5＇×2。
（12)1%戊二醛，10min。
（13)双蒸水5min 。
结果：在光镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表明有HBsAg定位在细胞浆内。
（二)蛋白A-金（PAG)放大法
为了得到更明确的染色结果，在用IGS方法定位细胞抗原时可采用搭桥法，使IGS得到放大，这里介绍一种用抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法。下面以5-羟色胺定位为例说明这一新方法。
（1)石蜡切片→脱蜡至水。
（2)1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
（3)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。
（4)1%EA封闭组织10min。
（5)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释兔抗5-羟色胺抗体（1：1000)4℃过夜，或者37℃1h。
（6)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。
（7)1%EA封闭10min。
（8)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释PAG（1：40)，37℃1h。
（9)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（10)1%EA封闭10min。
（11)抗A蛋白抗体（1：100)37℃。45min。
（12)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（13)加0.05mol/l pH7.4 TBS稀释PAG（1：40)，37℃45min。
（14)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（15)双蒸水振洗5min。
（16)1%戊二醛10min。
（17)双蒸水振洗5min。
（18)0.01%伊文思蓝2min，甘油封片。
光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用PAG染色深度得到加深，阳性结果得到放大。由于抗A蛋白抗体既能通过Fab段又能够通过Fc段与PAG上的A蛋白结合，因此，与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒。基本原理如下图5-3。
图5-3 PAG放大法原理
PAG放大法的优点：①使用试剂单一；②可大大提高IGS的敏感性，从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能；③背景干净。可以预见这一新方法将很快受到人们的关注。
