实验二十七 蛋白质的分子检测方法
每个菌细胞大约含有2000种的蛋白分子，这些蛋白质参与了细菌的各种生命活动，也构成细菌的各种特征信息，因此在分类学中已发展了许多技术，用来分离和研究蛋白质的特征，以作为系统研究的依据。常用的蛋白质的分子技术有十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)、Western印迹法(Westernblot)等。
一、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
【原理】
将待测蛋白质样品溶解于含有强阴离子去污剂(SDS)和还原剂的溶液中，加热使蛋白质解离，变性的多肽与SDS结合，结合的量与多肽的分子量成正比，该SDS多肽复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率也只与多肽的分子量大小相关。在饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4g去污剂，借助已知分子量的标准参照物便可测算出多肽链的分子量。用考马斯亮蓝或银盐对聚丙烯酰胺液进行染色，可清晰地显示电泳后的蛋白质图www.med126.com谱。
【材料】
1．10%十二烷基磺酸钠(SDS)、1.5mol/L Tris(PH8.8) 、1.0mol/LTris(PH6.8) 、10%过硫酸铵、30%丙烯酰胺溶液、四甲基乙二胺(TEMED)、灭菌去离子水、2×SDS凝胶加样缓冲液、β-琉基乙醇。
2．5×储存液(Tris碱9g；甘氨酸 43.2g；SDS 3g；用去离子水稀释至600ml，调pH8.3，4℃储存)。
3．溴酚蓝、考马斯亮蓝染色液、脱色液。
【方法】
1．洗净电泳玻板 用洗衣粉擦洗电泳玻板，自来水冲洗干净后，用单蒸水冲洗后晾干。
2．装板 将两块玻板对整齐，装入。
3．配分离胶 根据所分离的蛋白分子量和玻板的大小分别选择丙烯酰胺凝胶浓度和确定配胶体积。本实验选用10%丙烯酰胺凝胶(有效分离范围约在16～68kDa)，分离胶体积10ml，按下列体积吸取各种储存液：
灭菌去离子水： 3.3ml
30％丙烯酰胺溶液 4.0ml
1.5mol/LTris(PH8.8) 医学检验网; 2.5ml
10％(SDS) 100μl
10％过硫酸铵 100μl
TEMED 4μl
混匀(注意不要产生气泡)。
4．灌分离胶 将混匀的分离胶沿玻板壁缓缓加入两块玻板之间（注意不要产生气泡)，注意分离胶只能加到一定高度(插入梳子离梳子1～1.5cm,以便加浓缩胶)，上面覆盖一层灭菌去离子水,静置20～30min。
5．配浓缩胶 按下列体积吸取各种储存液，配制5ml浓缩胶：
灭菌去离子水： 2.7ml
30%丙烯酰胺溶液 0.67ml
1.0mol/LTris(PH6.8) 0.5ml
10%(SDS) 40μl
10%过硫酸铵 40μl
TEMED 4μl
混匀(注意不要产生气泡)。
6．灌浓缩胶 待分离胶聚合后(20～30min),倒掉上层的水.将混匀的浓缩胶沿玻板壁缓缓加在分离胶上面,然后插上梳子,静置20～30min。
7．样品处理 本实验检测IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)诱导大肠杆菌表达的重组蛋白。吸取100μl已培养表达的菌液于1.5mlEP管中，离心(5000rpm/min，2min)，弃上清，沉淀加入25μl2×SDS凝胶加样缓冲液和3μlβ-琉基乙醇,煮沸7min(注意：EP管盖须扎一针孔，以免沸液将管盖冲开)。
8．配电泳缓冲液 取60ml5×电泳缓冲液,稀释至300ml,即成1×电泳缓冲液。
9．加样 待浓缩胶聚合后(20～30min),取出梳子,用电泳缓冲液清洗凝胶加样孔.将两块玻板夹在电泳槽上,将电泳缓冲液倒满上下槽.用微量加样注射器吸取20μl样品,加到加样孔底部,每加完一个样品需用水清洗微量加样注射器。样品加完后如有剩余加样孔，应加上等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。
10．电泳 将电泳槽与电泳仪相接，正极(红色)接下槽。打开电源，恒压120V电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶，约20min，把电压提高到200V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部(约80min)，关闭电源。
11．卸胶、染色、脱色 取出电泳玻板，卸下夹子，小心取出凝胶。将凝胶放入一器皿内，倒入考马斯亮蓝染色液，放于平缓摇动的脱色摇床上于室温染色40min，倒出回收染色液，加入脱色液，平缓摇动约30min可见蓝色蛋白条带。
12．凝胶成像 将已脱色的凝胶置于凝胶成像仪上拍照。
二、免疫印迹(Western blot)法
【原理】
将蛋白质抗原样品变性，SDS-PAGE电泳分离的蛋白组分从凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上，利用抗原与抗体结合的特异性，与相应的一抗孵育，用二抗放大一抗检测到的信号，并显示检测信号，从而判断膜上有无待测蛋白质抗原的存在及量的多少。同时用蛋白质分子量Marker，还可判断待测蛋白质抗原的分子量。
【材料】
1．SDS-PAGE电泳试剂(见SDS-PAGE)、2×上样缓冲液(LoadingBuffer)、电转缓冲液、TBS、TBS-T、封闭液(BlockingBuffer) 、分离胶，Whatman 3M滤纸。
2．生物素标记的蛋白分子量Marker，一抗，二抗，化学发光试剂盒(AECKit)。
3．AECBuffer(AEC-3.35ml,0.1MAcetic-50ml,ddH2O2-50μl,filtrated with 2 membrane)。
【方法】
1．配制SDS-PAGE分离胶和浓缩胶。
2．取一定量蛋白质样品(使用前煮沸变性7min)，另取3～5μl生物素标记的蛋白质分子量Marker。
3．上样。
4．电泳：浓缩胶中恒压120V，电泳30min；分离胶恒压160～200V，电泳80min。
5．卸下分离胶，用电转缓冲液平衡洗涤1次，10min。
6．将硝酸纤维素膜(NC膜)在电转缓冲液中平衡10min，Whatman3M滤纸也同时在电转液中平衡。
7．电转仪上的装架：从负极到正极方向依次为：滤纸－胶－NC膜－滤纸，分别排除所有气泡。
8．接通电源，恒压100V，90min。
9．取出NC膜，用双蒸水洗涤1次，10min。
10．封闭液封闭NC膜，4℃静置过夜。
11．(第二天)：用TBST洗NC膜1次，10min。
12．用TBST稀释相应的一抗，与NC膜孵育1h，室温轻柔摇动。
13．用TBST洗涤5次，分别为1，2，3，4，5min。
14．用TBST稀释相应的二抗，与NC膜孵育1h，室温轻柔摇动。
15．用TBST洗涤5次，分别为1，2，3，4，5min。
16．用TBST稀释AB复合物，与NC膜孵育1h，室温轻柔摇动。
17．用TBST洗涤5次，分别为1，2，3，4，5min。
18．准备AECBuffer，NC膜加入AEC Buffer中，待其显色。
19．用双蒸水洗涤NC膜2次，晾干。
