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病原生物学出版教材-文字教材:高级医学微生物学(主编)第10章 肝炎病毒

病原生物学出版教材文字教材:高级医学微生物学(主编)第10章 肝炎病毒:第10章肝炎病毒肝炎病毒是指以侵害肝脏为主引起病毒性肝炎(viralhepatitis)的病原体,目前公认的人类肝炎病毒至少有5种,即甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病毒。近年来新发现一些与人类肝炎相关的病毒,包括庚型肝炎病毒和输血传播病毒。病毒性肝炎是目前感染率和发病率最高的传染病之一,已成为全球性的严重的公共卫生问题,影响近1/4人群的健康,至今仍缺乏特效疗

第10章  肝炎病毒

肝炎病毒是指以侵害肝脏为主引起病毒性肝炎(viral hepatitis)的病原体,目前公认的人类肝炎病毒至少有5种,即甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病毒。近年来新发现一些与人类肝炎相关的病毒,包括庚型肝炎病毒和输血传播病毒。病毒性肝炎是目前感染率和发病率最高的传染病之一,已成为全球性的严重的公共卫生问题,影响近1/4人群的健康,至今仍缺乏特效疗法。

第一节  乙型肝炎病毒

1965年,Blumberg等最先在澳大利亚土著人血清中发现了HBsAg,这是人类首次检测到肝炎病毒抗原,当时称“澳抗”。1970年,Dane等在电镜下鉴定出成熟的乙型肝炎病毒(hepatitisB virus,HBV)颗粒,即Dane颗粒。1980年Price等首先成功克隆了HBV DNA全基因。之后,HBV的基因组结构、基因变异、流行病学特征、致病机制、基因治疗和疫苗等研究进展非常迅速。

一、生物学特性

(一)形态结构

在电镜下,HBV可呈现3种不同的形态结构:Dane颗粒、小球形颗粒和管形颗粒(图10-1)。

Dane颗粒 又称大球形颗粒(图10-2),直径为42nm,具有双层衣壳。外衣壳相当于包膜,由脂质双层和蛋白质组成,镶嵌有表面抗原(hepatitisB surface antigen,HBsAg)和前S蛋白。用NP40等去污剂处理除去外衣壳后,暴露出电子密度较大、直径为27nm的20面体核心结构,其表面为内衣壳,内含核心抗原(hepatitisB core antigen,HBcAg)和e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)。内部是HBV的核心,含有DNA和DNA多聚酶(DNApolymerase,DNA-P)等。Dane颗粒是完整的HBV颗粒,具有很强的感染性。血清中Dane颗粒的检出是肝内病毒活跃复制的标志。

图10-2  HBV形态结构模式图

小球形颗粒  为乙型肝炎患者血清中常见的颗粒,含量比Dane颗粒高100~1000倍,颗粒呈球形,直径22nm,不含核酸及多聚酶,为组装Dane颗粒时游离到血液中的过剩的HBsAg。

管形颗粒  由许多小球形颗粒串联而成,长100~70nm,直径22nm。

(二)基因组结构与功能

HBV DNA的大小为3 215bp,是一未完全闭合环状双链DNA(图10-3)。

图10-3  HBV基因结构示意图

长链(L)为负链,完全闭合。短链(S)为正链,呈半环状,长度约为负链的50%~100%。负链3'端与正链5'端约250~300bp的粘性末端是维持环状结构的基础。粘性末端的两侧有直接www.med126.com重复序列(directrepeat,DR),其序列为5'TTCACCTCTGC 3'(11bp)。DR1在负链上的位置是1 824~1 834 nt,DR2在正链上的位置是1 590~1600 nt。DR区在HBV复制中起重要作用,如果改变2~3个核苷酸,病毒就可能停止复制,因此,DR区是设计反义寡脱氧核苷酸、核酶和突变研究的重要靶区。

HBV DNA的负链含有S、C、X、P4个开放读码框架(open reading frame,ORF) ,编码HBV全部的遗传信息,并且读码框架之间有相互重叠,使HBV基因组的利用率高达150%~200%(图10-3),无内含子。

S 基因区  位于2 854~0~832nt,全长1 185bp,分为三部分:S基因、preS2基因和preS1基因(图10-3,图10-4)。S基因由688bp组成,编码的小蛋白(或主蛋白)是HBsAg的主要成分。preS2基因由165bp组成,编码的PreS2蛋白与小蛋白组成中蛋白。preS1基因由324~357bp组成,编码PreS1蛋白,与中蛋白组成大蛋白。中蛋白及大蛋白主要存在于病毒颗粒中,暴露于管状颗粒的表面。

小蛋白、PreS1蛋白和PreS2蛋白都有很强的抗原性,其中HBsAg是目前乙肝疫苗的主要成分。动物实验证实,PreS1蛋白和PreS2蛋白具有比HBsAg更强的免疫原性,应开展PreS1和PreS2疫苗的研制。

C基因区  位于1 814~2 450nt,全长636bp,可分为preC基因和C基因,5'端有2个ATG。C基因长549bp,编码HBcAg,为核衣壳的唯一结构蛋白。第2个ATG与第1个ATG间的序列称为preC基因,由87bp 组成(1 814~1 900nt),编码的PreC蛋白具有信号肽(signalpeptide)和核信号(nuclear signal)功能。

自第1个ATG编码的产物称为HBeAg前体蛋白(212aa),信号肽将该前体蛋白引导到宿主细胞的内质网膜上,经蛋白酶降解切除包括信号肽(19aa)在内的N端及富含精氨酸的C端的部分序列后,即形成成熟的HBeAg,可分泌到血液中或与球蛋白结合。HBeAg为血清中能检测到的一种可溶性蛋白,HBeAg阳性提示HBV正处于复制状态。

P基因区 位于2 357~1 621nt,全长2496bp,是HBV DNA最大的ORF,占整个基因组的75%以上,与S、C及X区均有重叠。编码的P蛋白为多聚蛋白(95kDa),具有4个功能域(domain):引物酶(primease)、间隔区、逆转录酶和RNaseH,可被加工成多种分子量较小的产物,其中DNA多聚酶具有依赖DNA的DNA多聚酶、依赖RNA的DNA多聚酶、逆转录酶和RNase H活性。这些基因产物在HBVDNA复制过程中起关键性作用,P基因变异可能导致DNA复制改变,甚至中断。

X基因区 位于1 374~1 836 nt,大小约435~462bp,是最小的ORF,是HBV基因组内功能重叠最明显的区域,包括ENHⅡ(增强子Ⅱ)、Cp(核心启动子)和DR2(顺向重复序列2)。X基因所编码的X蛋白(hepatitisB X antigen,HBxAg)大小为145~154aa,是一种转录反式激活蛋白,对HBV多个启动子及增强子有激活作用,可反式激活HBV及肝细胞癌基因的转录调控元件,促进HBV复制和肝细胞癌变,还可活化多种异源的启动子及增强子,如HIV-1、HSV-TK、RSVLTR、SV40早期转录区的增强子及启动子。但X基因不与DNA直接结合,必须通过活化其它蛋白因子(如NF-κB)而起作用。

X蛋白可能是病毒的早期转录产物,多在复制活跃或致癌过程中表达,随后下降或消失。目前尚未能从血清中纯化到HBxAg,它仅出现在病毒持续复制和肝细胞炎症崩解的患者血清中,常见于慢性乙型肝炎、肝硬化与肝细胞癌患者。HBxAg抗原性很强,可诱发高水平的特异性抗体,

(三)复制

当乙肝病毒感染宿主肝细胞后,表现出与其它DNA病毒不同的生活周期。其显著特点是,在复制过程中存在病毒的前基因组形成过程和逆转录过程(图10-5)。

侵入  HBV PreS2蛋白具有聚合人血清白蛋白受体(polymerized human serum albuminreceptor),肝细胞表面亦存在这种受体,通过聚合人血清白蛋白介导,HBV可吸附到肝细胞表面。外衣壳经蛋白酶裂解后,暴露于表面的融合序列与细胞膜结合,介导HBV进入肝细胞,并在细胞内脱去内衣壳,裸露的松弛环状DNA进入核内。

闭环和超螺旋  在HBV DNA聚合酶的作用下,不完整的正链DNA以负链DNA为模板,复制成完整的双链DNA并超螺旋化,形成共价闭合环状DNA(covalentlyclosed circular DNA,cccDNA)。cccDNA可整合至肝细胞染色体基因组中。因此,可设计和寻找阻断cccDNA合成的药物用于抗HBV感染。

前基因组的形成  在细胞RNA多聚酶作用下,以cccDNA为模板转录形成至少5种长短不一的RNA。其中,3.5 kb RNA包含HBVDNA序列上的全部遗传信息,可作为HBV DNA复制的模板,故称为前基因组(pregenome RNA,Pg RNA),亦可转译成HBeAg和P蛋白。病毒的前基因组、蛋白引物及DNA多聚酶一起进入组装好的病毒内衣壳中;2.1kbRNA可转译成病毒的外衣壳中蛋白和主蛋白,提供原料供HBV颗粒组装;2.4kb RNA转译大蛋白。可设计反义RNA阻断mRNA的翻译或核酶降解mRNA,从而干扰HBV增殖。

逆转录  在病毒DNA多聚酶作用下,以Pg RNA为模板,逆转录为负链DNA。RNA模板迅速被病毒编码的RNase H所降解,再以新合成的负链DNA为模板,复制互补的正链DNA。可见,抑制DNA多聚酶活性有可能成为治疗乙型肝炎的有效途径。

装配与释放  长短不等的正链DNA与完整的负链 DNA形成未闭合环状双链HBV DNA,并与外衣壳蛋白装配成完整的有感染性的颗粒,从而产生出大量HBV颗粒,完成复制过程,在一定条件下经内质网以出芽方式释放至细胞外。

二、基因变异与基因分型

(一)基因变异

乙肝病毒DNA复制的一个最显著特点是经mRNA中间体进行逆转录,在这一过程中,由于DNA聚合酶缺乏校正功能而容易发生错配,因此HBV突变率较一般DNA病毒高。研究发现,第1896nt可由TGG变为TAG。第1 762nt、1 896nt位点的突变率分别为71%和33%。第1 762nt、1 764nt两位点上可出现双突变。这些重要突变的发现推动了HBV基因变异的研究。

HBV变异可发生在S、C、P、X四个读码框的任何一个区域内,其突变类型有点突变、缺失、插入、重排等多种类型。这些变异导致HBV生物学特性、致病机制、血清学标志物的改变,以及免疫逃避,在病毒感染的临床表现、诊断、预后及防治等方面带来诸多新问题。

S基因变异 S基因变异株的抗原性、免疫原性可发生相应的改变,并可能同时造成与之重叠的P基因变异而影响病毒的复制。S基因突变包括S亚型点突变和抗体逃逸突变。

S基因编码的HBsAg是HBV的主要抗原。HBsAg的抗原性较为复杂,有4个主要血清型:adw、adr、ayw和ayr。对各血清型基因组核苷酸测序表明,亚型的改变仅取决于个别碱基差异,因此,HBsAg编码区上的细小变化将可能引起抗原性发生明显变化。从免疫学角度考虑,如果中性的“a”抗原决定簇(aa124~aa147)发生变化,将会使常规免疫产生的抗体作用减弱或丧失。

S基因发生突变,常可导致乙肝疫苗保护失败。1990年,Carman等首先报道一种逃避疫苗免疫的变异株。在接种过乙肝疫苗的儿童中,个别儿童血清中具有较高的抗-HBs,但HBsAg及HBeAg均为阳性。通过对感染HBV的患儿及其母亲的S基因进行序列分析,在患儿体内HBVS基因上发现一个出现频率最高的点突变,即位于第587 nt的G→A,导致所编码的HBsAg第145aa Gly→Arg,这一位置恰好在“a”簇抗原决定簇上。单克隆抗体结合试验证明,抗-HBs与变异后的HBsAg结合力显著降低,导致患者血清中HBsAg阳性,而其母亲产前血清中HBV DNA无此突变。

我国学者在2例乙肝疫苗接种失败者中,发现HBsAg有第145aa及126aa的变异。

C基因变异  HBcAg和HBeAg由C基因编码,但合成的起始点不同。HBcAg是相对保守的,而HBeAg则高度变异,也就是说C基因突变主要发生在preC区。

既往认为,HBeAg转阴和抗-HBe的出现表示部分病毒被清除,肝炎症状缓解。但实际上并非所有HBeAg阴转的HBV感染者都趋于好转,相反,相当部分重型乙型肝炎的发生与HBeAg阴转存在一定的关系,而且部分HBeAg阴性患者血清存在高滴度的HBVDNA。究其原因,可能是HBV基因组多个位点的碱基变异导致患者血清HBeAg阴转,其中最常见的是preC基因突变,突变主要位点是第1 896 nt(G→A),使TGG→TAG(终止密码子),导致HBeAg不能合成和分泌,因而血清中检测不到HBeAg,但并不意味着HBV的清除或复制水平的减低。变异的发生可能与宿主的免疫反应、持续的慢性感染和干扰素或其他抗病毒药物治疗等因素有关。

另一个重要突变是C基因启动子变异,即第1 762 nt A→T,第1 764nt G→A的双突变,导致HBeAg转录障碍。该变异可能与暴发性肝炎、重症肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等有关。

P基因的突变 P基因编码HBV DNA多聚酶。在HBV的基因组中,发现有数处突变位点,其中,P基因的5′端第2798nt A→C,造成前基因组RNA不能正常包裹成核心颗粒,影响HBV DNA的正常复制。提示P区5′端为病毒关键性结构区域,在这一区域进行定点诱变,可使HBVDNA的复制停止,为HBV的基因治疗提供了一个重要的靶区。

X基因突变 X基因所编码的X蛋白可反式激活宿主细胞和HBV转录调控元件,在HBV复制和致病性中起关键性作用。X基因突变可能对HBV与宿主细胞相互作用具有重要影响,可增强或阻断HBVDNA的复制和表达。研究表明,在X基因的第1 770~1 777nt有8bp的缺失突变,影响C基因启动子和增强子ENHⅡ产生终止密码子。X蛋白C末端截去20aa后,可抑制HBV某些抗原的表达,使血清免疫学标记阴转。

(二)基因分型

    虽然HBV血清学分型在诊断和治疗中发挥一定的作用,但HBV各亚型与致病性和病毒复制的关系尚不十分清楚。HBsAg是诊断HBV感染的最重要、应用最广泛的血清学指标。HBsAg含有5种不同的抗原表位,分别是a、d、y、w、r,其中a为特异性的共同抗原决定簇。d/y及w/r是2对亚决定簇,d与y、w与r一般不同时出现在病毒颗粒中。根据HBsAg的血清学反应,HBV可分成adr、adw、ayw、ayr等4种不同的亚型,另外,还有5种混合型awr1、adwr、adwy、adyr、adwr2。各亚型的分布有明显的地区性,中国人以adr亚型居多。

近年来,人们试图在基因水平上对HBV进行分型。通过比较18株不同血清型的HBVDNA全序列,发现血清型的区分并不能真正反映基因组的差异。若将全基因序列差异≥8%定为不同的基因型,则可将这18株HBV分为A(adw)、B(adw)、C(adwadr ayr)、D(ayw)四个基因型。同一血清型可分布在不同的基因型之中,尤其以adw血清型的核酸序列变异程度最大,可分布在A、B、C三型之中。根据S基因之间的差异,又发现2个新的基因型:即E型(ayw4)和F型(adw4)。因此,HBVDNA可分为A﹏H8个基因型,并呈一定的地理区域分布。

根据不同基因型在某些区域的公共保守序列设计特异性引物,可用于扩增HBV DNA,或利用这些基因型在某些位点的差异设计探针,可进行基因分型。作者采用PCR-微板核酸杂交技术,对152例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBVDNA的基因型进行分型,结果表明,我国肝炎患者血清中的HBV DNA的基因型大多属于B、C和D三种基因型,所占比例分别为28.3%、37.5%、18.4%,并存在一定比例的混合基因型。

HBV基因分型的研究意义在于:①可了解不同基因型的致病性强弱,在某些地区,不同基因型HBV与不同程度的肝炎有明显的相关性;②考察抗HBV药物的疗效,确定哪一类药物对哪些基因型有效;③可观察疫苗对HBV不同基因型的预防作用。

三、致病性与免疫性

(一)传染源与传播途径

 传染源是乙型肝炎病人和HBsAg携带者。我国有1.3亿无症状HBsAg携带者,形成一个巨大的病毒贮存库。传播途径主要有:①经血液和血制品。急性乙型肝炎患者在HBV感染早期血液中病毒颗粒可达1010个/ml,此时,传染性最强。人对HBV极易感,接触微量污染血即可感染,输血、注射、外科或牙科手术、针刺、性行为、器官移植等均可传播;②母婴传播。主要在围产期感染。

(二)致病性与免疫机制 

乙型肝炎是一种世界性的传染性疾病,发病率高,有无症状携带病毒、急性肝炎慢性肝炎重型肝炎等多种临床表现。HBV感染的致病机制尚不完全清楚。虽然有实验证实,HBV感染的肝细胞可直接出现病变乃至死亡,但一般认为肝细胞损害并非由HBV直接造成的,而是通过在肝细胞内表达HBV抗原诱导宿主产生免疫应答,在识别抗原和清除病毒的过程中造成免疫病理损伤。因此,免疫因素(特别是细胞免疫)可能是HBV导致肝细胞损伤的关键。

HBV侵入机体后,免疫系统识别和提呈各种HBV抗原,使T淋巴细胞致敏,促进淋巴细胞增生,产生特异性抗体,中和游离的HBV及其抗原,并释放各种细胞因子,通过细胞毒性T细胞(CTL)、NK细胞和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)等,清除HBV感染细胞。

但是,HBV大量增殖后,过度表达的HBsAg和HBcAg在肝细胞内聚集,将诱发一定程度的免疫应答超敏反应,导致明显的细胞损伤。同时,HBV可引起肝细胞膜自身结构发生改变,暴露自身抗原如肝细胞特异性蛋白(liverspecific protein,LSP),诱发自身免疫损伤。致病机制可能有:

  (1)Ⅱ型超敏反应:病毒抗原刺激免疫系统产生病毒特异性抗体,LSP亦可诱导宿主产生自身抗体(抗-LSP)。抗体和肝细胞膜上的相应抗原结合,形成免疫复合物,继而激活补体,诱发补体依赖性细胞毒效应(CDC),或激活巨噬细胞、K细胞引起ADCC效应,从而引起肝细胞的损害。

  (2)Ⅲ型超敏反应:HBV抗原(或LSP)与其相应抗体形成免疫复合物,未能被及时清除,沉积于肾小球血管基底膜或关节的滑液囊等部位,激活补体系统,导致Ⅲ型超敏反应,引起关节痛、双侧对称性小关节炎、肾小球肾炎、皮疹、血管炎等肝外损伤。如果沉积在肝内小血管,可导致小血管栓塞,引起肝细胞坏死。

(3)Ⅳ型超敏反应:HBV在肝细胞内增殖时,细胞膜表面有大量的HBsAg或HBcAg表达,同时肝细胞膜受损暴露出LSP,从而使受染肝细胞为免疫系统视为异己,引起CTL杀伤靶细胞和TDTH迟发型超敏反应,TDTH释放淋巴因子,增强和激活其它T细胞,引起非特异性杀伤,K细胞发挥ADCC作用,NK细胞发挥自然杀伤作用,导致肝细胞损害。

许多证据表明,CTL应答在HBV的免疫损伤中发挥最重要的作用,其靶抗原主要为HBsAg及HBcAg。但是,最早可检测到的特异性T细胞免疫应答的靶抗原为PreS1,在肝细胞出现损伤前1个月就已出现,与血清中HBVDNA几乎同时出现。CTL对靶细胞的损伤并非以直接杀伤作用为主,主要通过Fas-FasL、穿孔素和颗粒酶依赖的细胞死亡信号,诱导肝细胞凋亡和坏死。

如果宿主受HBV感染的肝细胞数量众多,免疫应答水平较高,将有大量的肝细胞被破坏,常表现为急性乙型肝炎;免疫应答水平较低时,宿主不能有效地清除病毒,HBV感染及免疫损伤将在肝细胞中持续进行,表现为慢性乙型肝炎;而当宿主对HBV无免疫应答时,HBV不被清除,也不会导致肝细胞损伤,表现为无症状HBV携带状态。

(三)HBV感染慢性化机制 

HBV得以在人体内持续生存,必须能诱导一种无效的抗病毒免疫应答,或发展一种策略以逃避其它的有效免疫应答。可能机制有:

(1)免疫活性细胞耗竭:T细胞受HBV抗原激活后,除发挥免疫作用外,还可刺激T细胞受体(TCR)/CD3复合物,诱导自身Fas及其配体FasL、TNF及其受体等凋亡效应因子的表达,通过配体-受体结合和细胞内凋亡信号传递,诱导T细胞凋亡。特异性CTL的耗竭将导致HBV持续感染。

HBV亦可感染外周血单核细胞和淋巴结、脾、骨髓等免疫活性细胞,并表达病毒抗原,特异性CTL通过MHCⅠ类分子识别并杀伤受感染细胞,未被感染的T细胞也可和可溶性HBV抗原结合而被特异性CTL识别和破坏,从而导致机体的抗原提呈功能减弱,相关抗体及免疫活性分子产生不足,致使HBV感染慢性化。

(2)免疫区病毒再释放:HBV可感染淋巴细胞不能到达的组织或不能表达MHC分子的细胞,以逃避宿主免疫性清除。这些组织细胞可免遭免疫介导的组织损伤,成为一个潜在的病毒库,可源源不断地释放HBV,反复感染肝细胞而致感染慢性化。

(3)Th1/Th2型细胞之间的失衡:Th细胞可分为Th1和Th2两种亚型,前者可产生IL-1、IL-2、IL-12、TNF、IFN-γ等细胞因子,主要诱发细胞免疫反应,可清除细胞内病原体;后者可分泌IL-4、IL-5、IL-10等,辅助B细胞分化,产生抗体,主要促进体液免疫应答。Th1和Th2细胞之间可通过所产生的细胞因子发挥相互调节和制约作用。Th细胞亚群之间的比例适当,对保持机体正常免疫功能是必须的。

Th1/Th2型细胞因子不平衡应答可能是HBV感染慢性化的重要机制。研究发现,自限性HBV急性感染者中,Th1型应答为主,IL-2和IFN-γ水平明显升高,存在强烈的特异性CTL反应。而在慢性感染者中,IL-4、IL-5、IL-10等Th2型细胞因子水平升高,从而抑制Th1型细胞成熟,IL-12、TNF、IFN-γ含量下降。HBeAg可选择性削弱Th1型细胞应答,使其转向Th2型细胞免疫。由于Th1型细胞效应降低,Th2型细胞效应增强,导致机体清除HBV的能力下降,HBV感染呈慢性化。可见,针对慢性乙肝患者Th1型细胞因子的产生不足,可用外源性Th1型因子如IFN增强免疫以清除HBV。

(4)病毒抗原减少或缺失:HBV基因高突变现象可引起病毒复制和表达能力下降,使机体免疫细胞识别的抗原减少和缺失。例如,PreC基因突变可导致HBeAg不能合成与分泌,不能诱发有效的免疫反应,病毒难以清除,容易发展为慢性化感染。HBVDNA可与宿主细胞染色体整合,病毒表达的免疫原性抗原减少,从而逃避宿主免疫应答。

此外,HBV易发生变异,可能影响T细胞活化,或不能与抗体有效结合,使机体不能有效清除病毒。HBV感染慢性化可能还与宿主遗传因素有关。

(四)HBV与肝细胞癌 

HBV感染与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)密切相关,主要证据有:①90%肝癌细胞染色体中有HBVDNA整合现象;②土拨鼠实验证实HBV可诱发肝癌。转基因小鼠实验亦表明HBV的X基因高水平持续性表达可诱发HCC;③HBV感染者中HCC的发生率显著高于非HBV感染者;④HCC患者血清中HBV感染指标高于正常人群,HCC患者的HBV标志物检出率高于HCC发病前;⑤一些HBV感染患者肝组织内存在与HCC患者相同的毛玻璃样癌前细胞群,既有成熟肝细胞的形态与功能,又有胚胎细胞的特征,可表达甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP),经转化可发展为癌细胞。

HBV导致HCC的可能机制是:

(1)HBV损害DNA修复系统,成为肝细胞异常增殖的一个直接或间接的前提。

(2)大多数HCC患者染色体上有HBV DNA整合,且呈多拷贝,并可能是肿瘤中HBVDNA的唯一存在形式。HBV DNA整合后,可提高整合区DNA的变异能力,导致DNA发生突变、缺失、重排、易位等,使某些原癌基因的突变率升高;病毒启动子可启动邻近细胞调节基因表达;作为一种增强子插入顺序,加强癌基因的表达,使某些癌基因激活或某些抑癌基因失活。

(3)X蛋白可能是一种新的癌基因家族,在促进HCC形成、维持其早期肿瘤及恶性表型等方面有重要作用,主要依据有:X基因中含有多个直接重复顺序,是HBVDNA整合到染色体DNA的位点之一;X蛋白可反式激活一些癌基因,如c-myc、ras等;X蛋白可干扰蛋白酶转录因子的调节作用,异常激活某些基因表达,损伤肝细胞;X蛋白可诱导细胞生长及转化,在裸鼠中可致癌。

(4)HBV感染肝细胞后,敏感肝细胞死亡,耐受细胞存活并分裂增加。

四、微生物学检查法

在临床上,常用血清学方法检测患者血清中的乙型肝炎病毒抗原和相应的抗体。近年来,采用核酸杂交、PCR和基因芯片技术,从基因水平上检测HBV DNA,能早期、快速、准确诊断乙型肝炎,并建立了HBV DNA定量检测技术。

    血清学检测  临床上应用最为广泛的是用酶联免疫吸附试验(ELISA)对血清中HBV抗原及其相应抗体的检测,习惯称“两对半试验”。

1.HBsAg和抗-HBs  HBsAg是诊断乙型肝炎的重要指标之一,在乙型肝炎的诊断、治疗、预防和供血者的筛选等方面具有十分重要的意义。在HBV感染者血清中,HBsAg的浓度大多为5ng~600μg/ml。HBsAg阳性反映有HBV感染,处于急性肝炎的潜伏期或急性期,一般于病后1~4月内可消失。若持续6个月以上,可视为有向慢性转变的迹象。一般认为HBsAg滴度越高,HBeAg、DNAP和HBVDNA阳性的可能性越大,传染性也越强。

抗-HBs是HBsAg诱导机体产生的中和抗体,在感染过程中出现最晚,抗体的滴度与特异性保护作用呈正相关性,血清中出现抗-HBs一般提示患者对HBV的感染已有免疫保护力。从HBsAg阳性到抗-HBs阳性有一个“窗口期”,只有当血清中抗-HBs阳转及HBsAg阴转后,才说明病情向痊愈方向发展。

注射乙肝疫苗后,一般血清中会出现抗-HBs单项阳性。但临床中发现有HBsAg与抗-HBs同时出现于血清中,其原因可能是HBV出现变异,或存在不同亚型的混合感染,或已存在的抗-HBs对HBV变异株或亚型无中和作用。

此外,还发现接种乙肝疫苗后仍有少数的接种者对乙肝疫苗无应答,可能是接种者的B细胞缺乏合成抗-HBs的能力或免疫细胞缺乏HBV的特异性抗原受体,使HBV抗原的提呈作用受阻,不能诱发特异性免疫应答。

如果HBsAg和抗-HBs均为阴性,表示未接触过HBV,属于“易感者”,必须接种乙肝疫苗作保护。

2.HBcAg和抗-HBc  HBcAg存在于Dane颗粒核心部位的表面及受染的肝细胞核内。HBcAg在肝细胞核内合成,在胞浆内与HBVDNA装配成核衣壳,以出芽方式释放时表面包裹HBsAg,不易在血循环中检出游离的HBcAg,故很少作为常规检测。若HBcAg阳性,提示HBV在肝内处于复制状态并具有强传染性。

HBcAg抗原性强,在HBV感染早期即可刺激机体产生抗-HBc,较抗-HBs的产生早得多。机体首先产生抗-HBcIgM,随后产生抗-HBc IgG。抗-HBc IgG在血清中可持续多年,是既往感染过HBV的血清学指标。抗-HBc IgM高滴度说明HBV在体内复制,未检出抗-HBcIgM可以排除急性乙肝。抗-HBc IgM消失表示乙肝康复或转为慢性。抗-HBc不是保护性抗体,不能中和乙肝病毒。

3.HBeAg和抗-HBe  HBeAg是一种可溶性抗原。当乙肝病毒内衣壳裂解时,HBcAg被蛋白酶水解,释放出HBeAg。HBeAg的检出是HBV在体内复制及血清具有传染性的一个标志。在HBV感染早期,DNA的复制比较活跃,HBeAg与HBVDNA及HBsAg往往同时阳性,并与Dane颗粒出现的时间相吻合。提示患者具有高度的传染性。HBeAg阴性的患者,并不一定意味着病毒复制的终止。HBV慢性感染时,HBeAg常为阴性,表示病毒复制不活跃,传染性较弱。

HBeAg可诱导机体产生抗-HBe,抗-HBe对HBV感染有一定的保护作用。抗-HBe阳性则表示传染性小,病毒复制不活跃。抗-HBe出现于HBV急性感染的恢复期,持续时间较长,此时HBV几乎不复制,ALT降为正常,肝病趋向静止,是预后良好的标志。

“乙肝两对半试验”敏感性及特异性都较好,操作简便,结果易于观察,适合于临床大规模检测,主要用途有:诊断乙型肝炎,判断传染性,判断预后和评价抗病毒药物的疗效,筛选供血者,确定是否需要接受乙肝疫苗预防接种,开展流行病学调查(表10-1)。

表10-1  乙肝两对半试验的结果分析

HBsAg

抗-HBs

HBeAg

抗-HBe

抗-HBc

IgM   IgG

结  果  分  析

www.med126.com/rencai/

+   -

-   +

  +

-   +

急性肝炎潜伏期或早期

急性肝炎(传染性强,“大三阳”)

慢性肝炎(传染性强,“大三阳”)

急性肝炎趋向恢复(“小三阳”)

急性肝炎恢复期

既往感染过乙肝病毒

既往感染过乙肝病毒或接种过乙肝疫苗

无症状乙肝病毒携带者

未感染过乙肝病毒,为易感者

PCR技术  通过聚合酶链反应(PCR),可使极微量或单拷贝的HBV DNA在体外扩增到上百万倍,大大增加了对HBVDNA检验的敏感性,已广泛应用于基础和临床研究。值得注意的是,在实验过程中的各个环节应严格操作,加强对PCR试剂盒的质量控制,以避免假阳性或假阴性结果。

核酸杂交技术  HBV DNA 是诊断HBV 感染最直接的标志,因此,可采用核酸杂交技术直接检查血清中的HBVDNA。

1.膜杂交技术  将血清标本变性、转移并固定于硝酸纤维素滤膜上,经过预杂交封闭非特异位点,然后与HBV DNA探针进行杂交。通过放射自显影或显色分析,判断结果。该方法最大特点是简便,可不需提取核酸,特异性高,但灵敏度偏低,适合于HBV的基础研究。

2.PCR-微板杂交技术  首先通过PCR扩增HBV特异性DNA片段,然后通过固定于96孔微板(microplate)的捕获探针与待检的PCR扩增产物的某一区域特异性杂交,使HBVDNA吸附在微孔板上。最后,将非放射性信号探针与HBV DNA的另一区域杂交,漂洗后显色,经酶标仪判断结果(图10-6)。该方法用两个特异探针夹心杂交HBVDNA,特异性高于用一个探针杂交,杂交信号检测方便,显色反应类似于临床常规应用的ELISA,使用酶标仪,配合计算机,可实现自动化操作。在微孔板上可同时检测数十份标本,操作简便、快速,便于大规模检测临床标本。

  (PCR)

PCR产物

捕获探针    待测病原DNA

A  

 

   显色探针

96孔微板   B(地高辛) 显色底物

  (核酸杂交)

  

地高辛抗体  碱性磷酸酶   显色

(ELISA)

图10-6  PCR-微板杂交原理示意图

3.基因芯片(gene chip)技术  通过设计不同的探针微阵列(micro array),固3.基因芯片(gene chip)技术  通过设计不同的探针微阵列(micro array),固定于硅片支持物上,然后与荧光标记的HBV样品进行杂交,通过检测杂交信号的强弱判断样品中HBV的存在和含量。该技术可将许多不同类型的探针同时固定于支持物上,因此一次可对大量的HBV样品进行系统检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测HBV样品数量少、效率低等不足,而且还可以用于HBV的基因分型、基因表达、基因突变和序列分析等,具有广阔的应用前景。

定量检测技术  核酸杂交、PCR等技术能反映HBV DNA存在与否,但无法检测病人血清中HBV DNA的含量。在乙型肝炎的临床检测和治疗中,不仅需要敏感地判断HBVDNA的存在,更需要了解HBV DNA在患者体内的数量变化,以便判断患者传染性的强弱,考察疗效。

1.分支链DNA(bDNA)信号扩增技术  将磷酸化的捕获探针以共价键的形式结合在固相载体上,再加入样本HBV DNA和悬挂有上百个支链的信号探针进行杂交,每个支链DNA结合有信号放大分子(如每个核苷酸结合3个碱性磷酸酶),最后通过化学发光检测核酸的含量。该法作为HBVDNA直接定量检测技术,特异性好,但成本较高,不利于推广应用。

2.自动化荧光PCR扩增技术  该扩增体系所采用的引物除具有退火、延伸功能外,还包含2个额外基因,一是信号基因,单独存在时可以发光;另一个是抑制基因,可抑制信号基因的功能,不产生发光现象。在HBV DNA扩增时,由于Taq酶具有一定的5′外切酶活性,可将引物上的信号基因切下,信号基因失去了抑制基因的抑制作用而产生荧光。每扩增一次,引物退火、延伸一次,整个体系就会增加一个单位的荧光。该扩增技术在每一次扩增循环结束后都通过计算机识别荧光并记录下来,由此可得出每一次扩增结束后的动态产物量,用于DNA定量检测。不过,DNA定量检测技术尚需逐步完善。

五、防治原则

我国是HBV感染的高发区。据估计,乙肝病毒表面抗原携带者占总人群的10%(约1.3亿人)。每年有80~100万人患急性肝炎,约1/4患者转化为慢性肝炎患者,有75~150万女性HBsAg携带者通过母—婴传播使60~100万新生儿受HBV感染。更为严重的是,我国每年有30万人死于与乙肝相关的肝硬化及肝癌。

(一)预防

预防的关键在于切断传播途径和保护易感人群。对于急性患者,应早发现,早隔离,早治疗。对公用餐具及茶具等应经常消毒。患者应尽量少接触公用食品、水源及避免从事幼托工作等,并处理好排泄物。对高危人群应进行宣传教育,使之了解预防HBV的有关知识,减少感染和传播的机会。提倡使用一次性注射器具,对血液及血制品要严格筛选,以减少输血后乙型肝炎的发生率。对高危人群应采取以下特异性预防措施。

主动免疫  注射乙肝疫苗是最有效的预防方法。早在1984年,WHO呼吁应对婴儿及学龄前儿童进行广泛的乙肝疫苗接种,在全世界范围内控制HBV感染和降低乙型肝炎死亡率。1981年血源性乙肝疫苗在美国首先用于人群,并陆续推广到全世界。1986年在酵母中表达并纯化了HBsAg。随后,在其他载体系统中亦成功表达HBsAg。基因工程疫苗制备简单,易于大量生产,高效、安全,价格便宜,适合于大规模接种。

新生儿疫苗接种常用方案为“0-1-6”,即产后24h内、1个月及6个月分别接种一次,接种后有效的免疫保护力可维持多年。三角肌注射的效果优于臀部肌肉注射,皮内注射所需剂量少(约为肌肉注射的1/10),抗体的产生速度快,适用于大规模的免疫接种,但其免疫保护力明显低于肌肉注射者。随着年龄增长,对乙肝疫苗的免疫应答率及强度均逐渐下降,以儿童应答率最高、应答强度最强,而老年人最差。

我国是HBV高流行区,随着乙肝疫苗的广泛接种,特别是使<10岁儿童广泛接种疫苗,可使HBV感染率得到有效控制。我国现在已控制使用或淘汰血源性疫苗,大规模使用基因工程乙肝疫苗,并且加强PreS疫苗、抗原抗体复合物型疫苗、HBeAg合成肽疫苗、DNA疫苗和活载体疫苗等研究与开发。

被动免疫  对于HBsAg阳性母亲所生的新生儿、意外的医源性接触者、与HBV感染者有性接触者、受乙肝患者照料的不满1岁的儿童等,应及时注射乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitisB immunoglobulin,HBIG)进行被动免疫,两个月后需再重复注射一次,最好配合注射乙肝疫苗,可获得较好的保护效果。

(二)治疗

尽管乙肝疫苗的广泛使用在一定范围内对乙型肝炎起到有效的预防,但仍然存在少数无应答和不良反应等问题,而现有的患者和病毒携带者的治疗也是今后几十年中重大课题,因此,迫切需要寻找安全、有效的抗HBV药物。

抗病毒药物治疗  HBV治疗的首要任务是减少患者体内病毒载量,减慢慢性病变的进程。高效抗病毒药物选择性抑制HBV复制的作用靶点有2个:HBVDNA多聚酶及病毒转录后水平。目前对乙型肝炎的治疗尚无特效药。

1.干扰素(interferon,IFN) 作用于HBV DNA转录后水平,具有广谱的抗病毒作用(参见第12章),是迄今治疗乙肝最有效的药物之一。HBV感染后,患者的免疫系统出现紊乱,IFN产生不足,给予外源性IFN的替代治疗可获得良好疗效,其中以IFN-α的疗效最好。目前使用较多的、最经济、副作用最小和效果较好的治疗方案为“500万单位/次,3次/周,疗程4~6周”。IFN治疗三个月后,10%~15%患者出现HBsAg阴转。HBsAg消失后,75%~90%患者出现抗-HBs,但一般水平较低。不过,IFN对母-婴传播引起的HBV感染疗效更低,甚至无效。

2.核苷类似物  可迅速抑制HBV复制,已成为目前抗HBV药物的热点,但停药后感染复发率高。

拉米夫定(lamivudine,3TC)是一种脱氧胞苷类似物,进入肝细胞内形成三磷酸衍生物,可能通过抑制DNA聚合酶活性,干扰病毒逆转录过程,终止前基因组的合成,阻止HBV DNA复制。

据临床应用反映,几乎所有的乙肝患者适宜使用拉米夫定治疗。拉米夫定抗HBV治疗较安全,不良反应轻微,无明显的毒副作用,耐受性良好。但是,拉米夫定对肝细胞核内cccDNA合成无作用,故对已进入肝细胞的HBV无效,以致停药后易复发。使用拉米夫定治疗后,部分患者出现耐药性突变。耐药性的产生与多聚酶基因(polymerasegene,P gene)变异有关。目前发现P基因变异主要见于拉米夫定治疗的患者,变异是多位点的,但相对集中于P基因Tyr-Met-Asp-Asp(YMDD)区域。

泛昔洛韦(famciclovir)作用与拉米夫定类似,具有阻碍HBVcccDNA的产生,抑制DNA多聚酶,干扰逆转录作用,从而使未成熟的DNA链合成中断。在临床上具有良好的抗HBV疗效,适于不宜用IFN治疗和IFN治疗失败的患者、重症肝炎患者和肝硬化患者,但也可诱发HBVDNA突变。拉米夫定和泛昔洛韦联合用药和序贯用药可以提高抗病毒效果和推迟耐药性的产生。

苏拉明(suramin)具有抗逆转录病毒的作用,可抑制HBV DNA聚合酶活性,从而抑制HBV的复制。

无环鸟苷(acyclovir,ACV)对HBV DNA有抑制作用,与IFN联合治疗效果更好,去氧无环鸟苷能口服,但吸收较慢。

3.中草药 中草药是祖国医学的瑰宝。从中草药中提炼出有效成分,寻找抗HBV 的高效、无明显副作用、无耐药性的绿色药物是治疗乙型肝炎的一个发展方向,也是祖国传统医学发展的一次机遇。黄芪五味子山豆根柴胡、一枝花、白术茯苓地黄板蓝根、苦味叶下株、垂盆草华蟾素等对HBV有一定疗效。病毒学指标观察,经中药和成药治疗后,血清中的HBsAg和HBeAg阴转率可达30%~50%,肝功能有所改善。

基因治疗  将具有某种表达功能的基因导入体细胞内,使转录或翻译的产物发挥治疗作用,包括反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASON)技术和核酶(ribozyme)技术等(参见第12章),其抗病毒作用发生在病毒蛋白产生在前的基因水平。

1.反义寡核苷酸  包括反义DNA和反义RNA,可利用碱基互补配对原则而选择性抑制特定基因的复制、转录或翻译。ASON可对HBV 的poly(A)信号序列、preC基因、C基因、S基因的翻译起始点表现出明显的抑制作用。可针对HBV基因及其转录物的结构和功能及复制的主要环节,选择合适的靶位点,设计和合成特异的ASON,阻断HBV基因表达,为HBV的治疗开辟新的途径。

当将ASON以不同的药物浓度加入到HBV DNA转染的肝癌细胞系中,发现ASON片段能明显抑制DNA复制和表达,并且HBsAg的分泌表达水平显著下降。实验还证实,S基因AUG及其附近的核苷酸区域,是反义治疗的敏感靶位区,其抑制效果较强。采用ASON进行抗病毒治疗的不足之处是ASON难以大量制备,用于全身用药。

2.核酶  是一类具有酶催化作用,与特异性RNA以碱基配对方式结合而裂解靶RNA的RNA小分子。研究人员已对反义ASON各种修饰和未修饰型分子、单靶位核酶和多靶位核酶RNA分子都有较系统的研究,可望为抗肝炎病毒治疗提供新的可能性。

免疫治疗  乙型肝炎慢性化的主要原因是HBV感染所形成的免疫功能不全,体内高浓度病毒载量及对感染细胞的免疫耐受状态。因此,打破HBV感染后的免疫耐受状态将是治疗乙型肝炎的关键所在。

1.以治疗性疫苗为基础的免疫治疗  HBV治疗性疫苗可通过增强抗原提呈,诱导多种淋巴因子释放等途径来弥补或激发机体的免疫反应,特别是CTL的杀伤活性,并可克服机体对HBsAg的无应答状态,最终消除体内存在的病毒。

将PreS1第21~47位aa抗原肽的基因与HBsAg基因融合而成的重组质粒,免疫HBV转基因小鼠,可诱导高滴度的抗-PreS1和抗-HBs,并产生较强的HBsAg特异性CTL反应。高滴度的抗-PreS1的存在,将有利于清除慢性HBV携带者血清中的Dane颗粒,在治疗慢性HBV感染中发挥重要作用。

HBV DNA与细胞因子基因的重组DNA疫苗可较长时间刺激免疫细胞,改变机体对HBV各种抗原特异性Th细胞应答,例如,HBVDNA与IL-12、GM-CSF或IFN-α基因联合的疫苗明显促进Th1型免疫应答,对HBV CTL应答增强,而与IL-4基因联合的HBV DNA疫苗则明显促进Th2型细胞应答,有利于机体清除病毒,打破对HBV的免疫耐受。

2.以抗原提呈为基础的免疫治疗  APC是机体免疫反应的首要环节,能否进行有效的抗原提呈直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导。树突状细胞是机体免疫应答的始动者,在免疫应答的诱导中具有独特的地位。用HBV抗原多肽体外冲击致敏树突状细胞,或用IL-4、GM-CSF活化骨髓来源的树突状细胞,然后将之回输至宿主中进行免疫治疗,可打破免疫耐受状态,诱发机体产生HBV特异性CTL反应。

3.高效抗病毒药物与免疫调节剂的联合使用  应用细胞因子纠正机体Th1/Th2型细胞失衡对治疗HBV感染十分重要。免疫调节剂主要有干扰素、病毒唑(ribavirin)和胸腺素,它们具有免疫调节作用,能增强机体CTL和NK细胞功能,或促进受感染肝细胞表面HLAⅠ类抗原表达,从而提高细胞免疫介导的肝细胞-病毒“共灭活”反应。左旋咪唑是一种非特异性细胞免疫促进剂,能提高淋巴细胞转化率,诱生内源性干扰素。免疫调节剂还有转移因子、LAK/IL-2、猪苓多糖、免疫核糖核酸香菇多糖等,均可用于HBV感染的治疗。

但是,细胞因子或核苷类似物的单一治疗都不能彻底清除cccDNA,停药后大多数病例出现HBVDNA反跳,而且长期使用还可出现HBV毒株的突变,易形成耐药性。因此,可先用核苷类似物或干扰素减低体内病毒载量,恢复机体对细胞因子的免疫反应性,再辅以细胞因子治疗,提高特异性免疫功能应答,特异性破坏HBV感染细胞,使残留于肝细胞内的HBVcccDNA降解,达到彻底根治HBV感染的目的。

第二节  丙型肝炎病毒

1987年,WHO将非甲非乙型肝炎(non-A non-Bhepatitis,NANBH)分成两类,其中一类为输血或血制品传播的NANBH,即丙型肝炎。1989年,Choo等首次从NANBH黑猩猩血液标本中克隆了NANBH基因片段5-1-1,相应的病原体被命名为丙型肝炎病毒(hepatitisC virus,HCV),次年,获得HCV的全基因克隆。1991年,国际病毒命名委员会把HCV归入黄病毒科。近年来,HCV通过输血或血制品、血液透析、器官移植、手术等多种途径传播,具有高变异性,流行广泛,危害严重,目前又无理想的防治手段,因此倍受关注。

一、生物学特性

(一)形态结构与抵抗力

HCV颗粒呈球形,直径约30~62nm,由包膜、衣壳和核心三部分组成。包膜来源于宿主细胞膜,其中镶嵌有病毒包膜蛋白E1和E2。衣壳主要由核心蛋白(C蛋白)构成。核心为一单正链RNA。

HCV在体内的存在形式有:①完整的HCV颗粒;②不完整的HCV颗粒(如核心颗粒);③与免疫球蛋白或脂蛋白结合的颗粒;④由感染细胞释放的含HCV成分的小泡。

HCV对各种理化因素的抵抗力较弱,对酸、热均不稳定。用1:1000的甲醛37℃作用4d、加热100℃5min或60℃10h后,均可使HCV失去感染性。血液或血制品经60℃30h后可完全灭活HCV。氯仿等有机溶剂对HCV有较强的灭活作用。

(二)基因结构与功能

HCV全基因组长约9 379~9 481bp,基因组的排列为:5’UTR(非编码区)-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3’UTR(图10-7)。编码区占基因组全长的95%,为单一开放读码框,编码一个由3010~3033 aa组成的多聚蛋白前体(precursor polyprotein),在宿主细胞的信号肽酶及HCV本身编码的蛋白酶的作用下,裂解成10多种HCV功能性多肽,其中C蛋白、E蛋白为结构蛋白,NS2~NS5为非结构蛋白。各型HCV开放阅读框长度有所差异,主要是由于E2及NS5基因的插入或缺失突变所致。

图10-7  丙型肝炎病毒基因结构简图

5'非编码区  位于HCV基因组第1~341nt,变异率低。5'UTR含有3~5个AUG密码子,可形成稳定的二级结构,其中最靠近5'端的AUG在所分离的HCV分离株中均高度保守,对HCV的翻译调控最为关键。HCV5'UTR无帽状结构,但含有“内部核糖体进入位点”(internai ribosomal entry site,IRES)。在转录启始时,核糖体依靠IRES的不依赖“帽”结构的机制,直接与未“戴帽”分子结合来启动转录过程。

核心蛋白区  C基因位于第342~914nt之间,所编码的C蛋白具有包裹病毒核酸、维持病毒外形、调节宿主细胞的基因转录及表达等作用,是导致病毒持续感染及肝细胞癌变的关键因素。C蛋白具有很强的抗原性,可诱发高水平的特异性体液免疫及细胞免疫应答,在丙型肝炎疫苗研究中具有重要意义。几乎所有的丙型肝炎患者血清中都可检测到抗-C抗体,且持续时间较长,有助于HCV感染的确诊。

包膜蛋白区  E1基因位于HCV基因组第915~1 490nt之间,表达产物为E1蛋白(gp35)。E2基因位于第1491~2 768nt,表达产物为E2(gp70)。E1与E2蛋白通过非共价键相连形成异源二聚体,构成HCV完整的膜蛋白。E2蛋白在介导HCV吸附并进入肝细胞过程中可能起有重要作用。肝细胞膜上的低密度脂蛋白受体和CD18可能是HCV受体。

E区为HCV基因组中变异最大的部位,在不同的分离株中核苷酸差异可高达30%以上。在E2蛋白中,有2个高度变异区(highvariable region,HVR),其中HVR-1长为27aa。HVR-1编码基因的长度仅占整个基因组的8%左右,其变异率却占整个基因组的30%~47%。因此,在免疫系统选择压力的作用下,HVR可发生快速突变,导致HCV不断逃避宿主的免疫应答,引起持续性感染。抗-E抗体可协助机体清除HCV,尤其是HVR是表面抗原激发中和抗体最强的表位,因此,E蛋白是丙型肝炎疫苗的重要靶抗原之一,但其本身的高度变异性也给疫苗的研制带来巨大困难。

非结构蛋白区  由NS2~NS5基因组成,至少编码7种蛋白,其中NS3及NS5的功能较为明确。

NS2基因位于第2 772~3 419nt,编码的NS2蛋白可被加工处理为NS2a和NS2b,重组NS2称为p23蛋白。NS2在病毒复制中可能起着金属蛋白酶的作用,可裂解NS2~NS3前体蛋白。

NS3基因位于第3 420~5 312nt,表达多功能蛋白NS3(p72),其N端前1/3部分具有丝氨酸蛋白激酶功能,其发挥作用需要NS4A及NS2作为协同因子,各种非结构蛋白的产生都与之相关。由于丝氨酸蛋白激酶在病毒多聚蛋白前体的加工及各蛋白的成熟过程中发挥重要作用,故可作为抗病毒药物设计和筛选的重要靶点。NS3蛋白的后2/3具NTPase和RNA解螺旋酶活性。NS3蛋白的抗原性和免疫原性相对较强,是检测HCV感染的主要抗原之一,在诱导机体的抗病毒免疫方面有重要意义。

NS4基因位于第5 313~6 257nt,编码的NS4可被NS3蛋白激酶裂解成NS4A及NS4B。NS4A可稳定和增强NS3丝氨酸蛋白激酶活性,并能介导NS4B、NS5A、NS5B一起形成与病毒复制有关的复合结构。

NS5基因位于第6 258~9 374nt,编码的NS5可由NS3蛋白激酶裂解成NS5A及NS5B。NS5A可能与HCV的转录和翻译,以及NS5蛋白在细胞内的定位相关。NS5A的第2 209~2 248aa的变异与干扰素(IFN)的疗效有关,该区称为干扰素敏感决定区(interferonsensitivity determining region,ISDR)。NS5B可能主要编码RNA依赖性RNA多聚酶,参与指导HCV RNA的复制,但无特异性。NS5B含有一种与HCV复制相关的特征性序列GDD,是多聚酶识别RNA模板的序列。NS5B还具有外周核定位功能,提示HCV的复制位于核周围的内质网膜上。

3'非编码区  早期研究认为,3'UTR长27~55bp,末端有一个poly(A)或poly(U)尾,对HCV RNA结构稳定性的维持及病毒蛋白的翻译有重要功能。后来的研究证实,3'UTR包括4个部分:①一个短的约40bp的可变序列,其后有终止密码子;②一个同源poly(U)序列;③一个主要由U、少数C组成的多聚嘧啶序列;④一个高度保守的98bp的异源多聚序列,其3'末端有一个46bp的序列可形成稳定的茎环结构,对HCV负链RNA复制的起始可能具有重要意义,而无该序列的HCV基因组则无感染性。

二、基因变异与基因分型

变异是生物适应环境以及进化的重要方式,其结果可导致自然免疫、药物敏感性、致病机制及组织嗜性的改变等。准毒株(quasispecies)是由优势株及一群密切相关但又有所差异的突变株构成的RNA病毒群体,也称类似株、相似株、准种等。多次输血或使用血制品是血友病丙型肝炎患者体内HCV准毒株较多的主要原因。

(一)基因变异

不同地区的不同个体、同一个体的不同时相、同一样品的不同克隆之间,HCV序列都存在差异性。同一患者处于不同的感染状态时,体内的准毒株数量也有差异,并随病情的加重而增多,如慢性丙型肝炎准毒株数低于肝硬化,肝硬化又低于肝细胞癌。随着病程的延续,体内原先存在的某些准毒株逐渐消失,出现一些新的优势准毒株。

HCV RNA的突变率是原核和真核DNA复制突变率的106倍,达10-3~10-4nt/碱基位点·年,因此很难见到序列完全相同的2个HCV分离株。不同型的HCV核苷酸有20%~35%的差异,同一型的不同亚型,核苷酸及氨基酸的差异一般多在5%~8%及4%~5%。在肝炎的活动期,氨基酸及核苷酸的变异率可高达10%,而在静止期则较少发生变异。HCV变异以点突变为主,多为转换,颠换较少见。

HCV具有高度的变异性,产生机制主要有:①HCV的复制不需逆转录酶的参与,直接在RNA多聚酶指导下进行复制,而RNA多聚酶缺乏5’→3’校正功能,病毒复制可发生随机突变,复制中的错误掺入无法被校正,最终导致HCV的高度变异;②由于宿主免疫选择压力的作用,导致能有效激活宿主免疫应答的基因的变异率高于其它基因。抗-HCV抗体一方面具有阻止HCV与肝细胞的粘附作用,另一方面又迫使体内产生不同的准毒株以逃逸机体的免疫应答,使本来处于劣势的HCV准毒株被正选择成优势种群。

(二)基因分型

不同HCV分离株的核苷酸及氨基酸同源性有较大的差异,因此对HCV进行分型有助于了解各地区HCV的流行及进化情况,为HCV的诊断、治疗、预防等提供理论基础。但HCV分型尚无统一的标准。到目前为止,HCV至少可分为6个主要的基因型、40多个亚型及2~6个血清型。

三、致病性与免疫性

传染源和传播途径  HCV主要的传染源是患者和隐性感染者。传播途径多种多样,其中以吸毒、输血或血制品、血液透析、器官移植、手术传播、密切接触、垂直传播等为主。发达国家中不明原因的HCV感染占多数,吸毒者及性滥交者是HCV感染的主要传染源。我国由于血液及血制品HCV标志物筛选的敏感性稍差以及卫生习惯、观念等因素的制约,输血及血制品仍是HCV感染的最主要途径。

HCV损伤肝细胞机制  HCV感染的潜伏期平均约7周,只有少部分发展为急性丙型肝炎,其临床表现与其它病毒性肝炎相似,但症状较轻,主要表现为消化道症状,可出现黄疸、肝肿大、肝痛等。HCV感染后呈不同的感染状态,表现为隐性型、亚临床型、普通型、慢性型、暴发型等5种不同的临床类型。

HCV的致病机制尚不完全清楚,推测主要与HCV对肝细胞的直接损伤及宿主免疫损伤有关,自身免疫及细胞凋亡机制等也可能参与HCV的发病过程,其中以宿主的免疫损伤作用最为重要。

1.直接损伤作用  肝细胞是HCV复制的主要场所,HCV本身及其表达产物可直接对肝细胞产生毒害作用,HCV的复制也干扰了肝细胞内生物大分子的正常合成,增加溶酶体膜的通透性而改变肝细胞结构与功能,从而引起肝细胞病变,导致肝细胞肿胀、皱缩、核固缩等病理改变。

2.免疫病理损伤  HCV感染肝细胞后,可刺激宿主产生特异性及非特异性免疫应答,诱发特异性的免疫保护力,抵御HCV的再次攻击。但宿主在清除HCV的同时,也不同程度地破坏了自身细胞及组织,导致肝内外的一系列病理改变。

免疫介导的肝组织损伤可能模式为:HCV感染宿主后,抗原提呈细胞对HCV感染细胞进行处理,随后提呈给Th细胞并激活Ts/Tc细胞,通过CTL(Tc)效应直接杀伤表面表达有HLAⅠ类分子的受HCV感染的肝细胞。抗原提呈细胞也将抗原提呈给B细胞,诱发产生特异性抗-HCV抗体,通过补体介导的细胞毒作用(CDC)或/及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等效应清除HCV感染的肝细胞。

CTL对受HCV感染肝细胞的杀伤作用,可能是通过Fas介导的肝细胞调亡。受染肝细胞可表达Fas,带有FasL的CTL通过MHC、FasL和肝细胞表达的Fas结合,诱导肝细胞调亡,以有效清除HCV。如果某些因素引起肝细胞Fas过度表达,则可导致大量肝细胞死亡,形成暴发性肝炎。

HCV感染慢性化机制 国外报道的慢性肝炎中,60%~70%为慢性丙型肝炎,20%~30%慢性丙型肝炎患者可发展为肝硬化和/或肝细胞癌。急性丙型肝炎的慢转率约50%,甚至高达85%,但慢性化感染机制尚未完全清楚,可能原因有:

(1)HCV高度变异,逃避机体的免疫清除。HAV-1准种变异可能是HCV感染慢性化的一个原因。HVR-1含有抗体中和表位,但由于HVR-1高度变异,原HVR-1特异性抗体不能中和HVR-1变异株,使病毒逃避机体清除而在体内持续存在。

(2)HCV在肝组织及血液中含量低及诱导机体产生保护性的抗原性弱,导致免疫耐受,病毒不易被清除。

(3)机体免疫功能紊乱,尤其是Th1/Th2型细胞失衡。研究发现,在急性自限性HCV感染和慢性HCV感染的炎症活动期以Th1型细胞占优势,IL-2、IFN-γ等细胞因子分泌较多,促进细胞免疫,有利于病毒的清除,但导致肝细胞损害。慢性HCV携带状态及炎症静止期则以Th2型细胞免疫为主,IL-4、IL-10等细胞因子水平较高,Th1型细胞免疫应答低下,导致HCV长期持续感染。

(4)HCV可感染肝外组织如外周血单个核细胞、肾组织等,使之成为可能的储存库,为肝组织反复感染提供病毒来源,造成感染慢性化。

(5)病毒颗粒与低密度脂蛋白或抗体紧密联接,导致抗原决定簇被掩盖。

(6)HCV感染者体内CTL由于功能相对不足,不能有效地清除HCV感染的肝细胞。

HCV与肝细胞癌  由于HCVRNA不能整合到宿主基因组中,因而HCV所表达的蛋白质可能是引起肝细胞癌变的重要因素。

1.原癌基因和抑癌基因的改变  研究发现,HCV C蛋白具有增强或抑制细胞基因转录作用。C蛋白与癌基因ras协同作用可使大鼠胎纤维母细胞表现肿瘤基因表型。C蛋白还可激活原癌基因C-myc的启动子活性。p53具有抑制细胞癌变作用,当DNA发生损伤,p53可与DNA损伤部位结合,促进损伤修复。HCV的C蛋白和NS3蛋白可抑制p53基因转录启动子的活性,肝细胞的DNA损伤不能修复,积累后最终导致恶性生长。

2.细胞凋亡的作用  人类肿瘤的发生不仅涉及细胞异常增殖和分化,也与细胞凋亡的异常有关。肿瘤细胞的自发凋亡是机体抗肿瘤的一种保护机制,也是清除致肿瘤病毒的重要方式。HCVC蛋白可激活细胞内NF-κB,抑制TNF-α或Fas介导的细胞凋亡和阻止caspase-8活化(参见第4章),可延长受HCV感染细胞的生存,有利于病毒的持续感染和肝细胞癌的发生。

3.机体免疫力受到抑制  研究发现,肝癌组织中Fas表达减少,而FasL表达增强。高表达FasL mRNA的肝癌细胞常与淋巴细胞相邻,并使之发生凋亡,肿瘤细胞得以逃脱免疫系统的攻击。淋巴毒素β受体(LT-βR)与外周淋巴器官的发育以及淋巴器官的生发中心的形成过程有关,HCVC蛋白可与LT-βR结合,导致宿主免疫系统调节紊乱。HCV E抗原(尤其是HVR)在病毒复制过程中发生快速的变异,对T细胞受体介导的细胞免疫具有显著的抑制作用。

4.持续感染及细胞因子的作用  HCV持续感染引起肝细胞坏死、再生,多次反复导致肝硬化,在此基础上发生癌变。在肝细胞增殖亢进的状态下,染色体的不稳定性增加,基因突变率增高,从而启动肝细胞癌变。同时,HCV持续感染可造成细胞因子网络失调,出现转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)基因过度表达,而IFN-γ表达相对低下。TGF-α和IGFⅡ与细胞转化有关。HCVC蛋白可抑制IFN-β启动子,干扰IFN-β抑制HCV复制及抗肿瘤作用。

干扰素可诱导产生依赖RNA蛋白激酶(RNA-dependentprotein kinase,PKR),使真核细胞翻译起始因子2(elF-2)磷酸化,从而干扰病毒蛋白的合成,发挥抗病毒和抗肿瘤作用。然而,HCVNS5A干扰素敏感决定区与PKR结合,抑制PKR抗病毒和抗肿瘤作用。同时,NS5A在肝细胞内可发挥转录活化功能,影响细胞正常生长,出现细胞过度增殖。

四、微生物学检查法

丙型肝炎的确诊主要依靠肝功能检测、抗-HCV抗体、HCV RNA、肝组织HCV抗原的检测等,其中以前两者最常用。

抗-HCV检测  抗-HCV是临床诊断HCV感染最重要、最常用的指标之一,主要包括放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)、重组免疫印迹法(RIBA)等酶标记技术。用于检测抗-HCV抗体的EIA先后出现了4代,随着包被抗原及多肽的增加,其敏感性及特异性都明显提高。抗-HCVIgM对HCV感染的早期诊断、病情预测、疗效分析等有重要的意义,而抗-HCV IgG的诊断价值低于HCV RNA检测。我国自行研制的EIA试剂盒的质量基本达到国际上第二代EIA水平,但仍有约10%的漏诊率。

HCV RNA检测  HCV RNA是HCV感染的直接证据,HCV RNA检测对HCV的流行病学、致病机制、病情和传染性判断、疗效考察、预后预测等具有重要意义。检测HCVRNA的方法主要有逆转录-PCR(RT-PCR)、巢式RT-PCR、单管单酶PCR等,但因缺乏标准化与规范化,技术要求较高,不利于推广应用。

V抗原检测  丙型肝炎患者血清中HCV抗原(HCAg)水平很低,常规的免疫学、病毒学方法检测难以获得阳性结果,而肝组织中则易于检测到HCAg。HCAg检测方法包括免疫组化法、Westernblot、荧光酶免疫法、免疫PCR法等,其中以免疫组化最为常用,而荧光酶免疫法的检出率最高。HCAg的检测有助于直观评价HCV抗原在细胞中的表达情况、HCV致细胞病变及机体抗病毒的免疫机制等。

五、防治原则

HCV感染呈世界性分布,丙型肝炎的发病率约7.1/10万,目前全世界的HCV感染者超过1.7亿人,其中我国约占4000万。根据不同地区、种族、年龄、性别的人群HCV流行率,可分为:①低流行区:感染率<0.5%,主要分布于加拿大、北欧、瑞士、澳大利亚等地区;②中流行区:感染率在0.2%~2%间,主要分布于美国、西欧、南欧等地区;③高流行区:感染率>2%,如日本、东欧为2%~3%,非洲为2%~10%,我国属于HCV的高流行区。

(一)疫苗研究

接种丙型肝炎疫苗是预防HCV感染的理想途径。HCV的包膜蛋白是宿主攻击的主要靶标,是疫苗研制的首选抗原。

蛋白质疫苗  1994年,有学者将HCV重组痘苗病毒载体转染Hela细胞,表达E1-E2蛋白,分别于第0、1、7月三次免疫7只黑猩猩,诱发出高水平的体液免疫应答。在最后一次抗体高峰来临之前的2~3周,用同种HCV分离株攻击后,5只黑猩猩获得保护,另2只抗体滴度较低的黑猩猩感染了HCV,其中1只为一过性急性丙型肝炎。对照组4只黑猩猩全部感染上HCV,血清抗-HCV阳转。以上结果表明,HCV的包膜蛋白抗体具有一定的中和能力。

作者曾在HCV基因组中优选了5个高度保守的具有良好免疫原性的T/B细胞表位,组合成一个HCV多表位抗原,免疫小鼠、家、恒河猴、志愿者后,诱发了高水平的特异性免疫应答,初步试验证实具有一定的保护性。HCV多表位疫苗的研究,可望发展一种能针对不同型、不同HCV分离株的有效的丙型肝炎疫苗,解决HCV的变异难题。

核酸疫苗  与蛋白质疫苗相比,DNA疫苗能在体内表达与天然构象相似的抗原,诱导全面的免疫应答,特别是CTL效应,其最大的优点是可为高度变异的病原微生物(如HCV、HIV、流感病毒等)感染提供保护作用。

研究发现,将C基因重组质粒经肌肉注射BALB/c小鼠2~3次后,于第6周可检出较高水平的抗-C抗体。有学者构建了一系列HCV DNA疫苗表达载体,靶基因包括C、E1、E2、E1-E2、C-E1-E2及缺失HVR区的E2,这些重组载体免疫动物后,只有含C区基因重组DNA疫苗才能诱发特异性CTL免疫应答,但体液免疫应答和Th细胞的增殖作用较弱;而以E2为靶抗原的DNA疫苗诱导高滴度中和抗体,故E蛋白在DNA疫苗研究中倍受重视。

细胞因子可通过不同的作用环节调节和增强HCV核酸疫苗的免疫效应而发挥佐剂作用。HCV E基因与GM-CSF或IL-2基因的融合质粒免疫小鼠后发现,与仅含E基因的DNA疫苗相比,所诱导的抗体反应和淋巴组织增殖反应均大大增强,并且可产生针对异型HCV的抗体。

丙型肝炎/乙型肝炎嵌合核酸疫苗  HBV及HCV感染率都很高,感染途径类似。在体内,HCV与HBV可相互抑制,也可协同作用导致更为严重的肝损害,因此构建HBV/HCV嵌合疫苗具有重要意义。将C-E2全基因或部分基因与HBsAg基因融合后,构建成HBV/HCV重组质粒,免疫后可诱发特异性抗-C及抗-E2抗体反应,以及针对HCV及HBV的CTL效应。HBV/HCV联合疫苗的研究及推广应用,符合今后疫苗发展的方向。对于一些低免疫原性的多肽,插入到其它蛋白质中则可能诱发理想的免疫应答。

丙型肝炎疫苗迟迟未能开发成功的主要原因有:HCV的快速变异,抗-HCV抗体的无中和作用,缺乏稳定的HCV体外细胞培养系统及理想的小动物模型等。研制对各型HCV有保护作用的高效、价廉、多价、安全的丙型肝炎疫苗,是预防HCV感染最为迫切的难题。继续寻找HCV保护性B细胞及T细胞表位,阐明HCV的致病机制及其与宿主之间的相互作用,建立HCV感染的细胞模型及动物模型,将是制备有效丙型肝炎疫苗的基础。口服活菌苗、植物疫苗将可能是研制丙型肝炎疫苗的新途径,也必将受到关注。

(二)抗病毒治疗

丙型肝炎的临床症状往往不如乙型肝炎典型,但慢转率高,发展为肝硬化及肝细胞癌的比例大,因此治疗上比乙型肝炎更为困难,更为重要。丙型肝炎患者往往需要进行早期、综合、长期治疗等才能获得较好的效果。

干扰素治疗  IFN治疗丙型肝炎的疗效肯定,患者血清ALT、AST恢复正常,HCVRNA及抗-HCV阴转或滴度降低,肝组织学明显改善,可延缓慢性丙型肝炎向肝硬化及肝细胞癌发展。但是,IFN治疗持续应答率约20%~30%,原因在于某些HCV毒株具有抗IFN-α作用,主要机制是HCVNS5A蛋白破坏依赖RNA的蛋白激酶(PKR)。

中医药治疗  中药治疗丙型肝炎的疗效肯定,价格低廉,不良反应小,复发率低,适于推广应用。中医治疗丙型肝炎宜化瘀解毒、疏肝理气、补益肝肾等,单味药及其有效成分、方剂等都有确定的疗效,目前应用较多的有五味子、小柴胡汤等。中医药联合IFN、病毒唑等疗效较好。因此,寻找合适的方剂、在中药中提取治疗丙型肝炎的有效成分、探讨中西药联合治疗等应受到高度重视。

其它药物治疗  目前已发现一些药物,如病毒唑、熊去氧胆酸(UDCA)、胸腺素等对丙型肝炎有一定的疗效。病毒唑、UDCA与IFN联合治疗可望提高抗病毒能力。

基因治疗  HCV所致的病理改变最根本的原因是HCVRNA的存在,因此,从破坏HCV RNA的角度入手,彻底抑制HCV的转录及表达,是根治HCV感染的一条诱人的途径,以反义抑制治疗的研究最为成熟。HCV生活周期的任何步骤都可被人为阻断,与病毒复制或表达显著相关的组分是基因治疗的理想靶基因,例如,针对HCVC蛋白编码区的核酶有希望成为抗HCV感染的一种治疗途径。亦可设计包含有多个保守HCV抗原表位的多价融合抗原基因的治疗性疫苗,可以在人群的不同个体中诱发对不同HCV基因型和分离株有交叉反应性的T细胞免疫应答。

第三节  其它肝炎病毒

一、甲型肝炎病毒

甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)为一种单正链无包膜的球形RNA病毒,直径为27~32nm,20面体对称结构,属于小RNA病毒。1973年,Feinstone等用免疫电镜技术从病人大便中首次发现HAV颗粒。HAV基因组长7478bp,由5’非编码区、编码区和3’非编码区组成。HAV只有1个血清型,但各分离株间同源性有一定差异,至少可分为7个基因型。HAV在80℃下10min仍不能完全灭活,对化学消毒剂有较强的耐受性。

甲型肝炎的传染源主要是急性期甲肝患者及隐性感染者,传播途径以粪-口途径为主,即通过污染的水源和食物传播,少数经血液、尿液和密切接触等传播。绝大部分HAV感染者为亚临床感染。HAV主要在发展中国家流行,而在发达国家则呈下降趋势。

我国HAV感染发生率高于70%,且有上升的趋势,有些地区甚至居传染病首位,农村的感染率高于城市。1988年,上海市暴发流行甲型肝炎,4个月内患者多达31万,死亡47例,病死率为15.3/10万,成为我国建国以来最大的一次甲型肝炎流行,在世界甲型肝炎流行史上也是前所未有的。经流行病学调查证实,HAV感染的毛是这次流行的罪魁祸首。

对甲型肝炎的治疗无特效药,目前应用于临床的HAV治疗药物有2,4-二氯嘧啶、板兰根等。甲型肝炎为一种自限性疾病,预后良好,经适当的休息及护肝治疗,一般可痊愈。抗-HAV是获得特异性免疫力的一个重要标志,在抗-HAV阳性率超过50%的群体中不易发生HAV大流行。

1979年,HAV首次在细胞中培养成功。1992年开始使用HAV疫苗接种。目前我国已经能大量生产减毒活疫苗H2株、F’株,广泛用于免疫接种,并获得理想的预防效果。

二、丁型肝炎病毒

1977年,意大利学者Rizzetto在检测乙肝患者组织切片时,除观察到HBcAg外,还发现当时称为δ抗原的新抗原。1980年,从实验动物中检测到完整的病毒颗粒。1984年,δ因子被更名为丁型肝炎病毒(hepatitisD virus,HDV)。

HDV为一单负链RNA病毒,长约1678~1 683bp,核酸以环状或线状两种形式存在,共含有9个ORF。ORF5能编码特异性抗原HDAg和大HDAg(HDAg’),前者可反式激活HDVDNA的复制,后者则通过显性失活的反式调节作用,抑制HDV DNA的复制。后来证实,HDV为一种缺陷的卫星病毒,必须在嗜肝DNA病毒辅助下才能复制。

丁型肝炎的传染源是慢性丁型肝炎患者,经输血或血制品、密切接触和母-婴途径传播。HDV的组装依赖HBsAg的合成,故HDV的流行病学与HBV相似,HDV的感染往往合并HBV的感染。HDV的致病机制尚不清楚,可能与HDAg的直接损伤和免疫因素等有关。

对丁型肝炎尚无特效治疗药物,IFN、磷酸三钠等对HDV/HBV感染有一定的疗效。反义RNA、核酶等对HDV的复制有抑制作用,具有潜在的治疗价值。HDV与HBV感染密切相关,因此HDV的预防应先预防HBV感染。乙肝疫苗的广泛接种及血液的严格筛查可降低HDV的感染率。

三、戊型肝炎病毒

1968年,Goldfield等发现约10%的输血后肝炎患者并无HAV、HBV感染的血清学标志,认为还有其它类型肝炎病毒存在,并把这类致病因子引起的疾病称为非甲非乙型肝炎(NANBH)。1987年,WHO将NANBH病毒分为2种:一是经输血或血制品传播,即丙性肝炎病毒;另一是经消化道传播,即戊型肝炎病毒(hepatitisE virus,HEV)。

HEV属于杯状病毒科(Calicividae),为球形颗粒,直径为27~34nm,无包膜,表面有锯齿状突起。病毒颗粒有2种不同的形态,一种是内部完整的致密颗粒,另一种是有缺陷的内部透明的不完整颗粒。HEV为长约7.5kb的单正链RNA病毒,基因组由5'NCR、ORF、3'NCR组成。

HEV的敏感宿主为人和灵长类动物等。传染源是潜伏末期和急性早期戊型肝炎患者及亚临床感染者,传播途径有粪—口途径和密切接触等,主要通过污染的水源而导致大规模暴发流行。HEV传播有明显的季节性,多发生于雨季或洪水后。

人感染HEV后主要表现为临床型及亚临床型感染两类。该病为自限性疾病,于发病后6周可自然恢复。戊型肝炎患者一旦病愈,则获终生免疫。本病无特异性预防措施,应保护水源,防止粪便的污染,注意食品卫生。虽然HEV主动免疫可诱发高水平的抗体反应,但抗体效价很快降低,且无中和保护作用,因此难以制备有效的疫苗。

四、庚型肝炎病毒

利用免疫学及分子生物学等检测手段可将肝炎病毒分为甲、乙、丙、丁、戊5种,但仍有10%~20%的肝炎病原体不能检测和分型,提示还存在其它未明的肝炎致病因子。

1995年,Simon等采用代表性差异分析法(representationaldifference analysis,RDA),从接种病人血清的狷猴中获得3个肝炎相关序列:GBV-A、GBV-B和GBV-C。1996年,Linnen首先克隆了HGV全序列。之后,王海涛、戚中田等分别报道中国株和日本株HGV的全长cDNA。由于GBV-与HGV同源性很高,因此现在更趋向把GBV-C与HGV统称为庚型肝炎病毒(hepatitisG virus,HGV)。

  HGV属于黄病毒科,为单正链RNA病毒,颗粒直径<100nm。HGV全基因约9.1~9.4kb,编码的多聚蛋白分为结构蛋白及非结构蛋白。结构蛋白位于N端,包括E1及E2蛋白;非结构蛋白位于C端,包括NS2、NS3、NS4A/4B、NS5A/5B蛋白。NS3含有丝氨酸蛋白酶、解旋酶,NS5编码RNA聚合酶等,其蛋白裂解位点与HCV多聚蛋白相似。

庚肝病毒感染呈世界性分布,传染源多为庚型肝炎患者,主要经输血等肠道外途径传播。由于庚型肝炎病毒和HBV、HCV具有共同的传播途径,所以也存在HGV和HBV、HCV合并感染的现象。

五、输血传播病毒

1997年,Okamoto和Nishizawa等应用代表性差异分析法,发现了一种可能与输血后肝炎相关的病毒,由于该病毒首先从一姓名字首为TT的患者血清中分离得到,且该患者有大量输血史,故称为输血传播病毒(transfusiontransmitted virus,TTV)。

TTV为单链环状DNA病毒,无包膜,基因组全长3739bp,有2个开放读码框,其中,ORF1位于第589~2 898nt,编码由770aa组成的蛋白质,ORF2位于第107~712nt,编码非结构蛋白(202aa)。采用套式PCR扩增和测序后,已证实TTV首尾两端连成环状,中间有113bp,富含GC,比例达90%,其中还有一个TATA盒。因此,TTV是迄今发现的第一个人类环状病毒(humancircovirus)。

TTV基因具有很大程度的异质性。有学者对78株TTV病毒标本进行测序,将TTV分为2种基因型,型间核苷酸差异大于30%,每型还可分成2个亚型。亦有人对93份来自不同地区的TTV标本进行基因序列分析,认为TTV可分为6个基因型。1999年,有人证实了这6种基因型的存在,同时又发现一种新的基因型。

TTV在各类人群中均有较高的感染率。TTV除了经输血传播外,也可经粪—口途径传播。骆抗先认为,TTV可能是另一种肠道传播型肝炎病毒,引起非甲非庚型病毒性肝炎。性病高危人群亦是TTV感染的高危人群,性接触是TTV感染的重要途径之一。TTV从胆汁中高浓度排入肠道,并经大便排出体外,可以导致粪—口传播,这与甲肝、戊肝消化道传播的途径极为相似。TTV是否引发急、慢性肝炎,TTV是否与肝癌的发生有关,目前尚未定论。

2000年,Takahashi等报道了一种新的肝炎病毒—TTV类似小病毒(TTV-like mini virus,TLMV)。TLMV是一种类似TTV和CAV的人类病毒,无包膜,全长2 860bp,比TTV(3 739bp)短,比CAV(2317bp)长,环状DNA,颗粒直径小于30 nm。其基因组结构类似TTV和CAV,具有DR结构。TLMV的亲缘关系介于TTV和CAV之间,与其它环状病毒有很大不同。

综上所述,各种肝炎病毒的生物学特征、致病机制、临床表现和预治等存在着一定的差异(表11-2)。人类与肝炎病毒的斗争仍在不断进行中,至今为止,世界范围内的不明原因的肝炎仍占8%~10%,导致这些肝炎的病原体及其致病性不十分清楚,仍需继续寻找新的肝炎病毒。

表11-2 各种肝炎病毒主要指标的比较

指标

HAV

HBV

HCV

HDV

HEV

HGV

分类

微小RNA

病毒科

嗜肝DNA

病毒科

黄病毒科

卫星病毒科

杯状病毒科

黄病毒科

直径(nm)

27

42

30~62

36

27~32

核酸

线状正链RNA

环状双链

DNA

线状正链

RNA

环状负链

RNA

线状正链

RNA

单正链RNA

大小(kb)

7.8

3.2

9.4

1.7

8.5

9.1~9.4

ORF

1

4~6

11

9

3

1

包膜

抗原

HAAg

HBsAg

HBcAg

HBeAg

HCAg

HDAg

HEAg

抗体

抗-HAV

抗-HBs

抗-HBc

抗-HBe

抗-HCV

抗-HDV

抗-HEV

抗-HGV

潜伏期(d)

15~45

30~160

14~180

28~140

15~75

21~140

起病

多急性

多缓慢

多缓慢

多缓慢

多急性

缓慢

好发年龄

儿童

成年/儿童

成人

成人

青壮年

儿童

传播方式

粪-口

肠道外传播

性接触

母婴传播

输血

性接触

肠道外传播

性接触

母婴传播

粪-口

输血

注射

接触

流行性

散发/流行

散发

散发

散发

流行/散发

散发

季节性

秋冬季

雨季

慢性化(%)

0

3~10

50~70

2~70

0

?

致癌危险

++

?

预防重点

水粪管理

饮食卫生

疫苗接种

控制医源性感染

控制医源性感染

水粪管理

饮食卫生

   

(万成松 黄建生  第一军医大学)

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