第八章比色分析法
第一节 比色分析法的基本原理
比色分析法（colorimetry analysis)是基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，又称为吸光光度法。
有色物质溶液的颜色深度与其浓度有关。有色物质溶液的浓度和液层的厚度越大，颜色越深。利用光学方法比较溶液颜色的深浅，可以测定溶液的浓度。
比色分析法具有简单、快速、灵敏度高等特点，广泛应用于微量组分的测定。通常可测定含量在10-1~10-4mg·L－1 的痕量组分。比色分析法如同其它分析一样，也具有相对误差较大（一般为1%~5%)的缺点。但对于微量组分的测定来说，由于绝对误差很小，测定结果也是令人满意的。在医学学科中，比色分析法被广泛应用于药物分析、卫生分析、生www.med126.com/pharm/化分析等方面。
一、物质的颜色和光的关系
光是一种电磁波。自然光是由不同波长（400~760nm)的电磁波按一定比例组成的混合光，通过棱镜可分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色相连续的可见光谱。如把两种光以适当比例混合而产生白光时，这两种光的颜色互为补色，如图8-1所示，直线两端颜色的光互为补色。
图8-1 光的互补色示意图
当白光通过溶液时，如果溶液对各种波长的光都不吸收，溶液就没有颜色。如果溶液吸收了一部分波长的光，则溶液呈现透过溶液后剩余部分光的颜色。例如，我们看到KMnO4溶液在白光下呈紫红色，就是因为白光透过溶液时，绿色光大部分被吸收，而其它各色的光都能透过。在透过的光中除紫红色外都能两两互补成白色，所以KMnO4溶液呈紫红色。
表8-1 溶液的颜色与吸收光颜色的关系
| 溶液的颜色 | 绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 青蓝 青 | |
| 吸收光 | 颜 色 | 紫 蓝 青蓝 青 青绿 绿 黄 橙 红 |
| 波长/nm | 400～450 450～480 480～490 490～500 500～560 560～580 580～600 600～650 650～760 |
同理，CuSO4溶液能吸收黄色光，所以溶液呈蓝色。由此可见，有色溶液的颜色是被吸收光颜色的补色。吸收越多，补色的颜色越深。比较溶液颜色的深浅，实质上就是比较溶液对它所吸收光的吸收程度。表8-1列出了溶液的颜色与吸收光颜色的关系。
二、朗伯－比尔（Lambert--Beer)定律
当一束平行单色光（只有一种波长的光)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液（见图8-2)。设入射光的强度为I0。溶液的浓度为c，液层的厚度为b，透射光强度为I，则
图8-2 光吸收示意图
Kb
上式中表示光线透过溶液时被吸收的程度，称为吸光度（absorbance，A)或消光度（opticaldentsity，O.D.)。因此，上式又可写为：
上式为朗伯－比尔定律的数学表达式。它表示一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。
式(8-2)中K为吸光系数， 当溶液浓度称为透光率（transmittace)，用 T 表示，透光率和吸光度的关系如下：
(8-3)
当 c以质量浓度(g·L-1)为单位时，吸光系数用a表示，称为质量吸光系数；当
如果测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图可得一条曲线，即物质对光的吸收曲线，可准确地描述物质对光的吸收情况。
图8-3是几种不同浓度KMnO4溶液的吸收曲线，溶液在波长525nm附近的吸收最强，而对其它波长的光吸收较弱。光吸收程度最大处的波长叫做最大吸收波长，用λmax表示。不同溶液的KMnO4溶液所得的吸收曲线，最大吸收波长都一致，只是相应的光被吸收的程度不同。
图8-3 KMnO4溶液的吸收光谱曲线
吸收曲线可作为比色分析法中波长选定的依据，测定时一般选择λmax的单色光作为入射光。这样即使被测物质含量较低也可得到较大的吸光度，因而可使分析的灵敏度较高。
若所测定的溶液无色，可在测定前加入适当的显色剂，通过与待测成分发生化学反应使溶液显色即可测定此待测成分。
例8-1 已知在525nm处KMnO4溶液的ε＝2235L·mol-1·cm-1，若用2cm比色皿，为使所测得的透光率介于20%－65%之间，溶液的浓度范围是多少？
解：若T＝20%
则
若T＝65%
则 c= 4.19×10-5(mol·L-1)
因此溶液的浓度范围是1.56×10-4 ~ 4.19×10-5mol·L-1。
第二节 比色分析法的测定方法和应用
一、目视比色法
用视力比较样品溶液与标准品溶液的颜色深浅以确定物质含量的方法称为目视比色法（visualcolorimetry)。
目视比色法的根据是：被测物质和已知浓度的标准物质在同样条件下显色，当两溶液液层的厚度相等且颜色深度相同， 即吸收度相同时，则两者的浓度相等。
目视比色法常用的是标准系列法。
标准系列法（standard series method)是在纳氏比色管中进行测定的。纳氏比色管是一套由同种玻璃制成的大小形状完全相同的平底玻璃管，有的具有玻塞或塑料塞。其容积有10mL、20mL、50mL、100mL等数种，管上具有标线以表示容量。比色管放在下面有反光镜的比色管架上进行比色。
标准系列法的操作步骤如下：
先配制一个已知浓度的标准溶液，然后取一定量标准溶液按照由少至多的次序置于规格相同的比色管中，加入显色剂并稀释至一定体积，摇匀，成为一系列颜色由浅至深的标准色阶。另取一定量的样品溶液，用同样方法，在同样条件下使其显色并稀释至相同的体积，制成样品比色液（其颜色深度应在标准色阶范围内)。然后将样品比色液与标准色阶逐一比较，如样品比色液的颜色与标准色阶中某一标准比色液的颜色相同，则此两者的浓度相等。如样品比色液的颜色介于某两标准比色液的颜色之间，则可取它们浓度的平均值作为样品比色液的浓度，再根据稀释倍数求出样品溶液的浓度:
比色时可在自然光下进行。以漫射光为光源，各管受光情况一致，比色时可用平视法和俯视法，也可观察反光镜中各管颜色深浅的影像。我们常用的pH试纸就是采用的标准系列法。
标准系列法所用仪器简单，操作方便，液层厚度大，适用于测定低浓度溶液，在野战条件下应用广泛。但比色时须先配制一系列标准色阶，而标准色阶不宜长期保存需临时配制，同时目视比色也容易引入视觉误差，影响分析结果的准确度。
二、分光光度法
（一)分光光度法
分光光度法（spectrophotometry)是以钨灯或氢灯光作光源，经单色光器分光后，以所需波长的单色光作入射光，通过测定溶液吸光度来求算溶液中被测物质含量的一种分析方法。所用的仪器称为分光光度计（spectrophtometer)。分光光度计的型号很多，但其基本原理相似，主要部件表示如下：
光源→单色器→吸收池→检测器→放大器→指示器
1. 光源 可见分光光度计中，采用6~12V的钨灯作光源，其最适宜的波长范围是360~1000nm，为使光的强度稳定，须用稳压装置来稳定电压。紫外分光光度计中的光源为氢灯和钨灯各一个，可按需要进行转换。氢灯可用于200～400nm波长范围的紫外分光光度法测定。
2. 单色器 分光光度计采用单色器来控制波长。它可以把连续波长的光通过棱镜或光栅、狭缝和准直镜等分解成所需波长的单色光。狭缝宽度应适中，狭缝太宽，单色光纯度差；狭缝太窄，则光通量过小，影响测量灵敏度。
3. 吸收池 分光光度计中用来盛放溶液的容器称为吸收池或比色皿。它是用无色透明、厚度均匀的玻璃制成的。其透光的两面严格平行。同一系列的测定中，所用的比色皿必须配套，即同一配套比色皿盛有同一溶液在同一波长时测得的透光率不得越过0.5%。实验时可根据溶液的浓度不同选择0.5、1.0、2.0、3.0cm不同规格的比色皿。比色皿要保持清洁，透光面要注意保护，不得用手直接接触或用粗糙的滤纸擦拭，以免划伤表面，影响吸收程度，若外壁有液珠，应用滤纸吸干后再用擦镜纸擦净。紫外分光光度计的吸收池须用紫外光易通过的石英制造。
4. 检测器 可见分光光度计中的检测器一般用光电管，它是由一个阳极和一个用光敏感材料制成的阴极组成的真空二极管。当光照射到阴极时，金属表面发射电子，流向电势较高的阳极而产生电流。紫外分光光度计的光电管有红敏（625～1000nm)和蓝敏（200～625nm)两只，可通过手柄转换。光越强，阴极表面发射的电子越多，产生的光电流也越大。
5. 放大器和指示器 光电管产生的电流较弱，约为1×10-6A，需经放大器放大后输入指示器。指示器一般为微安电表、记录器、数字显示器和打印机等。在微安电表的标尺上同时刻有吸光度和透光率，如图8-4所示。透光率刻度是等分的。因吸光度与透光率是负对数关系，所以吸光度刻度是不均匀的。
图8-4 吸光度与透光率标尺
图8-5 72系列分光光度计光学系统示意图
很多精密型分光光度计采用屏幕显示吸收光谱、操作条件及各项数据，并可与计算机联用，使测定更为方便，高级职称考试网也扩大了分光光度法的应用范围。图8-5为72系列分光光度计的光学系统示意图。由光源发出的连续辐射光线射于聚光镜上，经平面镜转角90°反射到入射狭缝，射入单色器。入射光经过准直镜反射后，以一束平行光射向背后镀铝的棱镜而发生色散，从棱镜色散后的光线经过准直镜反射在出射狭缝上，再经过聚光镜后进入比色皿。经溶液吸收后的透射光通过光门照射在光电管上转换为光电信号，经过放大后输入检流计，由电表直接显示出吸光度。
（二)可见分光光度法的测定方法
可见分光光度法常用于定量测定，最常用的测量方法有如下两种。
1. 标准曲线法
标准曲线法是分光光度法中最常用的方法。配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称工作曲线)。然后将被测溶液置于吸收池中，在相同条件下，测量其吸收度，并在标准曲线上查出其相应的含量。该方法对于经常性批量测定十分方便，采用此法时，应注意使标准溶液与被测溶液在相同条件下进行测量，且溶液的浓度应在标准曲线的线性范围内。
在测定溶液吸光度时，为了消除溶剂或其它物质对入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面对光的反射等与被测物质吸收无关的因素的影响，必须采用空白溶液（又称参比溶液)作对照。常用的空白溶液有下列三种。
（1)溶剂空白 当显色剂及制备试液的其它试剂均无色，且溶液中除被测物外无其它有色物质干扰时，可用溶剂作空白溶液，这种空白溶液称为溶剂空白。
（2)试剂空白 若显色剂有色，试样溶液在测定条件下无吸收或吸收很小时，可用试剂空白进行校正。所谓试剂空白，是按显色反应相同的条件加入各种试剂和溶剂(不加试样溶液)后所得溶液，相当于标准曲线法中浓度为“0”的标准溶液。
（3)试样空白 当试样基体有色(如试样中混有其它有色离子)，但显色剂无色，且不与试样中被测成分以外的其它成分显色时，可用试样空白校正。所谓试样空白，是指不加显色剂但按显色反应相同条件进行操作的试样溶液。
2. 标准对照法
若仅对个别样品进行测定，且
先配制一个与被测物质溶液的浓度相近的标准溶液，与被测溶液在相同条件下测定吸光度，根据下式可以计算。
A标= K标b标c标
A测= K测b测c测
由于使用同一波长的入射光，采用同样的比色皿，测定同样的物质，所以
K标= K测
b标=b测
因此
即
（三)可见分光光度法的应用—铁的含量测定
1. 原理 分析测定溶液中铁的含量有硫氰酸盐显色法、磺基水杨酸法及邻菲罗啉显色法等各种方法。现以磺基水酸杨法为例介绍铁的含量测定。
在不同酸度下，Fe3＋和磺基水杨酸生成组成不同的配合物。若控制溶液pH值在8～11.5条件下显色，可生成配位数为6的黄色三磺基水杨酸合铁配合物。反应式如下：
Fe3++3HSal- [Fe(Sal)3]3-+3H+
溶液的最大吸收波长为420nm，因此可在420nm处进行测定。此方法适合于测定无大量Cu2+、Ca2+、Ni2+、Cr3+等离子存在的溶液中铁离子的含量。
2、操作步骤
(1)标准曲线的绘制 称取一定量硫酸铁铵［NH4Fe(SO4)2·12H2O］， 用蒸馏水溶解，加适量硫酸酸化，配制成含Fe3＋0.1g·L－1的标准溶液，再稀释成含Fe3＋0.025mg·L－1 的操作液。
取25mL容量瓶6只，编号后分别加入操作溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，各加入10%NH4Cl溶液2mL和10%磺基水杨酸溶液2mL，滴加氨水至溶液由紫红色变为黄色，并使氨水稍过量，然后用NH4Cl－NH3 缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，以1号为空白，在420nm处依次测定吸光度。以Fe3＋含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(2)样品的测定 取25mL容量瓶1只，准确加入经过处理的浓度在标准曲线范围内的被测溶液，按上面标准系列配制的同样方法加入等量的显色剂和缓冲溶液，在相同的条件下测定被测溶液的吸光度，利用标准曲线找出样品溶液的浓度，根据样品溶液的稀释倍数，求出样品的含量。
例8-2 用邻二氮菲测定铁时，已知每毫升试液中含Fe2＋0.500μg，用2.00cm吸收池于508nm波长处的吸光度为0.198，计算三（邻二氮菲)合铁（Ⅱ)配合物的ε（508nm处)。
解：cFe2+ = ×10-6×1000 = 8.96×10-6(mol·L-1)
因为 A = εbc
所以 ε= = 1.10×10-4(mol·L-1·cm-1)
习 题
1. 为什么KMnO4、CuSO4溶液呈现不同的颜色，它们各吸收了哪些波长范围的光？
2. 什么是质量吸光系数？什么是摩尔吸光系数？两者关系如何？为什么要选用波长为λmax的单色光进行分光光度法测定？
3. 什么是吸收光谱？什么是标准曲线？各有什么实际应用？
4. 分光光度计主要由哪些部分组成？各起什么作用？
5. 已知透光率为20%和80%，分别计算其吸光度。已知吸光度为0.25和0.56，分别计算其透光率。
6. 已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmol·L-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数ε和质量吸光系数
答案
5. A：0.70，0.097；T：56%，28%
6.
