油酸型呼吸窘迫综合征的发生与治疗 【实验目的】 复制油酸型呼吸窘迫综合征（respiratory distress syndrome ，RDS)动物模型，初步探讨其发病机制。观察药物对油酸导致的急性肺损伤的防护作用。学习肺顺应性（pulmonary compliance)、肺系数、肺泡灌洗液表面张力等指标测定方法。 【实验原理】 化学性因素油酸所致急性肺损伤主要是通过激活补体，产生趋化因子使中性粒细胞与巨噬细胞在肺内聚集、激活，释放大量氧自由基、蛋白酶和花生四烯酸代谢产物等炎性介质，对肺泡-毛细血管膜的损伤，使之发生通透性增高等变化而引起以肺水肿为主要病变的RDS。后者能导致通气/血流比值失调及肺泡-毛细血管膜的弥散障碍，发生换气功能障碍而引起呼吸衰竭。 肺顺应性是指肺在外力下的可扩张性，与肺弹性阻力成反比。肺顺应性可用单位跨肺压引起的肺容积变化来表示。RDS时，由于肺泡结构破坏、肺泡表面活性物质减少等因素导致肺顺应性下降，进而影响肺通气功能。 三莨菪碱（654-2)、二甲基亚砜（DMSO)、维生素C（VitC)、维生素E（VitE)等均为有效的抗氧化剂，可对抗炎症反应导致的过氧化损伤。在静脉注射油酸前，先给予上述药物，观察其对RDS时肺损伤的防护作用。 【实验器材和药品】 充气检压装置、显微镜、血细胞计数器、哺乳类动物手术器材1套、兔手术台、生理盐水、气管插管、注射器(100ml、10ml各1支)、20ml量杯、50ml烧杯2个、0.05ml刻度吸管2个。酒精灯、25%乌拉坦、油酸、654-2，50 %DMSO、医用液体石蜡。血气分析仪。 【实验动物】 家兔，体重约2.5kg。 【实验方法和步骤】 一、实验分组 取家兔3只称重，分别固定于兔台上，耳缘静脉缓慢注射25%乌拉坦4ml/Kg麻醉。颈部手术作气管插管、颈总动脉插管。观察一般状况和记录呼吸频率及深度。从颈总动脉采血，测定手术后血气各项指标（血pH、Pco2、Po2)。随机将家兔分为3组： 1. 油酸RDS动物模型组 耳缘静脉注射油酸0.1ml/Kg，30分钟后观察并记录呼吸的改变，再追加油酸0.1ml/Kg，每10分钟观察记录呼吸变化，待呼吸等症状明显时，采血，测定注射油酸后的血气指标。 2. 实验治疗组 可选择654-2或DMSO治疗。用654-2治疗：2mg 654-2溶于25ml生理盐水中，耳缘静脉注射（20min注完)，再注射油酸（剂量和程序同“油酸组”)。用DMSO治疗：耳缘静脉注射50 %DMSO 10ml/kg，20min后再注射油酸（剂量和程序同“油酸组”)。 3. 对照组 耳缘静脉注射生理盐水0.2ml/Kg，注射程序同 “油酸组”。 二、观察项目 1．观察各组家兔呼吸频率及深度变化、血气指标的变化。待油酸组出现明显症状，如烦躁、呼吸急促、甚至仰头呼吸，鼻腔喷出粉红色泡沫等，立即取血测定外周血白细胞（WBC)。 2. 外周血WBC测定 用针头刺破各组家兔耳缘静脉，取血测定WBC，具体步骤参照附录。计算计数盘四角大方格WBC总和（Y)，外周血WBC = Y ′ 50 ′ 106 /L。 3．家兔左肺顺应性的测定 （1)实验装置连接 如图6-3，安装充气检压装置，使水检压计一端侧管与一玻璃三通管相连，一端经橡皮管与气管插管相连，另一端经橡皮管与100ml注射器相连。在与注射器相连的皮管中间，再接一三通玻璃管，游离的一端接一短皮管。用止水夹控制其启闭，以调节检压系统的压力平衡。做充气用的注射器内涂少量石蜡油，以防漏气。
图6-3 充气减压装置 （2)手术 ① 用铁锤猛击各组家兔枕部使之猝死，仰卧位固定在兔台上。用粗剪刀剪除颈部及胸部正中区域的毛，在颈部正中作4cm长的纵行切口，暴露气管。 ② 用止血钳分离气管周围组织，下面穿线备用。在气管甲状软骨下1cm做一倒“T”切口，插入直型气管插管并结扎固定。 ③ 然后沿胸骨右侧剪开胸壁，再沿气管分离出右主支气管，用止血钳夹闭右主支气管及其肺门血管。 ④ 在左侧胸壁选一肋间隙用止血钳钝性分离肋间肌，仔细穿破胸膜造成气胸，使左肺萎陷（注意不要损伤肺脏)。 ⑤ 剪断胸骨两侧的肋骨，除去胸骨，暴露肺脏。观察各组肺的一般性状。 （3)左肺的压力-容积曲线测定 先把充气检压装置的注射器内吸入50ml空气，然后将胶管一端连于家兔之气管插管上，此时注意检压计之液面是否在零位。如不在零位可打开注射器前端之T形管侧管，调整水检压计使零点与肺同高，以平衡肺内压。以后缓慢推进注射器向肺内充气，至水检压计读数达2cm处，间歇10s，记录充气量。若在间歇期检压计液面有少许下移，可继续充以少量空气，以保持原来压力水平。以同样的方法，依每次递增2cm水柱的肺内压向肺内充气，直到整个肺完全扩张，同时记录每次肺内压增加的肺内充气量。以充气时的压力变量为横坐标，以充气时的容积变量为纵坐标，绘制压力-容积曲线。以同样的原理立即制备抽气时的压力-容积曲线。对照组家兔可在左肺用生理盐水灌洗后（见下)，再重复测定压力-容积曲线，比较两者的变化。 4. 左肺支气管-肺泡灌洗、支气管-肺泡灌洗液（broncho-alveolar-lavage fluid，BALF)WBC计数和蛋白的测定 (1) 将充气检压装置的橡皮管从气管插管上取下，用10ml注射器抽取生理盐水8ml，从气管插管注入左肺内，改变家兔体位，尽可能使生理盐水冲洗到每一肺叶，然后将BALF回抽并倒入20ml量杯内。重复以上述方法灌洗左肺2次，记录灌洗液的回收量，备用。 (2) 按照本节附录计算计数盘中四个大方格中WBC总和（Y)。BALF的WBC总数按下列公式算出：Y′50′回收液ml数′103。 (3) 用直接烧灼法定性测定BALF蛋白浓度：把各组家兔的BALF 3～4ml注入试管。在酒精灯上烧灼上方的液面，比较混浊的程度。混浊程度越高表示液体的蛋白含量越高。 5. 灌洗液表面张力定性观察 把灌洗液倾入50ml烧杯内，再用另一50ml烧杯装入生理盐水，使其液面大致与灌洗液相仿。分别插入0.05（或0.1)ml之刻度吸管，读出两种液体在吸管内的上升高度。液面上升高者表面张力大，反之表面张力小。 6. 肺系数测定 沿止血钳上缘剪断右主支气管及肺门血管，取出右肺称重计算肺系数（右肺重g′2/体重Kg)。 【实验注意事项】 1. 制备一无损的气管-肺标本，是实验成败的关键，手术过程要细心，特别要将肺与周围脂肪组织相区别，因其颜色近似。 2. 实验中要保持肺组织的湿润。 【讨论思考题】 1. 顺应性的概念，表达方法及与弹性阻力之间的关系是什么？顺应性大小与肺容积之间有无关系？ 2. 比较注气、抽气与作支气管肺泡灌洗后再灌气所得两条压力－容积曲线，可作出什么推论？ 3. 注入油酸后压力-容积曲线有何变化？ 4. 耳缘静脉注入油酸后，家兔有何症状出现？为什么？ 5. 根据血气指标变化，分析家兔呼吸衰竭的类型和发病机制。 6. 根据实验所得资料、数据，分析油酸型RDS可能的发病机制。 附录：WBC计数 原理：将血液或BALF用WBC稀释液（1%盐酸、稀龙胆紫液)稀释，使红细胞破坏溶解，WBC稀释液中的龙胆紫可使WBC的核染上颜色，使WBC形态更加清晰之后进行计数，求得血液内WBC数/mm3。 步骤： 图6-4 细胞计数板的结构
1. 熟悉血细胞计数板构造（见图6-4) 2. 仪器洗涤 实验前应先将血细胞计数板洗涤干净。吸血管中的血迹应先用自来水洗去后，再用蒸馏水洗三遍，然后吸入95%酒精洗两次，以除去管内的水分。最后吸入乙醚1～2次，除去酒精。每次排除管内的洗涤液时，可用手把橡皮管摺曲，挤压数次便可驱尽。吸血管洗净后应毫无血迹和水珠，其中的玻璃小珠应能自由转动而不致粘在管壁上为合格。计数板在用自来水和蒸馏水相继洗净后，即用擦镜纸试干，切不可用酒精或乙醚洗涤，以免损坏计数板上的刻度。 3. 在低倍镜下观察血细胞计数室（见图6-5) 4. 准确将WBC稀释液0.38ml加到小试管中。 5. 吸血 用WBC吸血管吸血到20 mm3，擦去尖外多余血。将血液加入到稀释液中，混匀。 6. 将血液加入稀释液中，混匀。 7. 充液 取盖玻片平放在计数板上，手执吸血管，吸取将要测定的液体，然后将吸血管口轻轻斜置于盖玻片边缘，滴出少量液体，此时液体由于毛细管作用而进入计数室内。注意：如果计数室内留有气泡或液体过多以至溢出室外凹沟中，都应该洗去重新充液。 8. 计数 充液后静置3分钟，在低倍显微镜下找到“井”形大方格，计数其四个大方格的白细胞。
图6-5 改良牛鲍尔（Neubauer)氏血细胞计数室
计算计数盘中四角的四个大方格中WBC总和，再乘以50而得每立方毫米血液内的白细胞总数。如四个大格WBC总和为Y，则： Y/4（变为每平方毫米)′10（变为立方毫米)′20（稀释倍数)=Y′50（个/ mm3) 酸碱平衡紊乱 【实验目的】 1. 复制动物呼吸性酸中毒、代谢性酸中毒和代谢性碱中毒等三种类型的酸碱平衡紊乱模型。 2. 观察三种类型酸碱平衡紊乱引起的机体机能和血气指标的改变。 【实验原理】 通过夹闭部分气管插管模拟气道阻塞，静脉输入乳酸和碳酸氢钠等方法，造成家兔呼吸性酸中毒、代谢性酸中毒和代谢性碱中毒等三种类型的酸碱平衡紊乱模型。检测各项机体功能指标的改变和进行动物血气分析，观察三种类型的酸碱平衡紊乱对机体的影响。 【实验器材与药品】 BL-420E生物机能记录系统，血气分析仪，家兔手术台1套，哺乳动物手术器械1套，家兔气管插管，动脉插管，动脉夹，50mL注射器2支，1mL注射器5支，头皮针1支，直径10mm橡皮塞5个。 3%戊巴比妥钠，5%乳酸溶液，5%碳酸氢钠溶液，1%肝素溶液。 【实验对象】 家兔，雌雄不限 【实验方法和步骤】 一.手术操作 1．抓取家兔称重，3%戊巴比妥钠1mL/kg耳缘静脉注射麻醉，仰卧固定在手术台上。 2．剪去颈部被毛， 在颈正中做4-5cm切口，分离气管做气管插管。连接BL-420E记录系统，选择输入信号，经第1通道：呼吸，描记呼吸曲线。分离左侧颈总动脉，穿双线备用。 3. 耳缘静脉注入1％肝素1mL/kg进行全身抗凝，留置头皮针待用。 4. 结扎颈总动脉远心端，近心端用动脉夹夹闭。经尽量靠近远心端结扎处用眼科剪剪一“V”字形切口，向心方向插入动脉插管。连接BL-420E系统, 经第2通道，选择输入信号：压力，描记血压曲线。 5. 用1mL注射器吸取少量1％肝素，湿润内壁后排出多余肝素。通过动脉插管三通管采集动脉血1mL，随后迅速把注射器针头刺入橡皮塞，并使注射器在掌中来回滚动混匀，立即用血气分析仪进行血气指标的测定。随后观察并记录呼吸幅度与频率、心率、血压等指标并填入下表（表 6-2)。 6. 用止血钳夹闭一侧气管插管的2/3，造成气道阻塞。持续10min，观测并记录心率、呼吸幅度与频率等指标。采用上述方法采集动脉血1mL，测定血气指标。 7. 待动物呼吸恢复正常后，经耳缘静脉缓慢注入5％乳酸溶液15mL/kg，同时注意观察并记录呼吸幅度与频率、心率、血压等指标。按上述方法取动脉血1mL，测定血气指标。 8. 经耳缘静脉留置的头皮针处，注入5％碳酸氢钠8mL/kg。注射完毕，观察并记录呼吸幅度与频率、心率、血压等指标。按上述方法取动脉血1mL，测定血气指标。 9. 经头皮针处，注入5％碳酸氢钠15mL/kg。注射完毕，观察并记录呼吸幅度与频率、心率、血压等指标。按上述方法取动脉血1mL，测定血气指标。 二．观察指标 1.心率、血压，呼吸幅度与频率。 2. 血气指标：pH，PCO2，PO2，SB，AB，BB，BE，[K+]，[Cl-]。 【实验注意事项】 1. 用来检测血气的血液一定要于空气隔绝，动作要快，否则会影响结果。 2. 乳酸对血管有一定的刺激作用，在注射过程中要防止动物挣扎。 3. 乳酸与碳酸氢钠溶液的注入一定要缓慢，最好能维持在2mL/min。 【讨论思考题】 1. 试比较三种类型的酸碱平衡紊乱在血气方面的改变有什么不同，各有何特点？ 2. 三种类型的酸碱平衡紊乱对呼吸与心率、血压各有什么影响？ 表 6-2 实验结果记录 类型 pH PCO2 PO2 SB AB BB BE 呼吸 心率 血压 频率 幅度 | 正常 呼吸性酸中毒 代谢性酸中毒 代谢性碱中毒 |
（陆丽) 实验 6. 7 微循环观察及失血性休克 【实验目的】 1. 观察微循环以及在失血性休克的变化； 2. 复制失血性休克的动物模型，观察休克发生发展过程中血压和微循环血流等的变化，加深对于“休克发病的关键不在于血压，而在于血流”的理论认识。 3. 设计抢救方案，加深对休克防治原则及所用药物药理作用的理解，培养独立分析问题、解决问题的能力。 【实验原理】 微循环是指微动脉至微静脉之间的血液循环。典型的微循环由微动脉、后微动脉、毛细血管前括约肌、毛细血管网、直捷通路、动-静脉吻合支和微静脉等部分组成。按照微循环学说，休克发生的关键是微循环灌流障碍；根据病情进展，微循环变化可分为缺血性缺氧期、淤血性缺氧期和微循环衰竭期。 导致休克的原因有多种，其始动环节都是血容量急性降低、急性心泵功能障碍和血管容量迅速扩大。家兔的血容量可按体重（g)乘以8%来估算（ml)。急性出血，出血量在血容量的10%以下，机体通过代偿机制可不表现症状；出血量达20~30%，动物发生休克；出血量达50%，动物死亡。 失血性休克的临床表现是血压明显下降、皮肤苍白、四肢冰冷、尿量减少、中心静脉压下降, 此外还有心率、呼吸增快等。 抢救休克的原则是去除病因、扩容、纠酸、合理使用血管活性物质、使用药物保护细胞以及防止器官衰竭。据此，同学们可自行设计抢救方案。 【实验器材和药品】 BL-420E生理科学实验系统，兔手术台，压力换能器，呼吸流量换能器，BI2000医学图象分析系统，恒温灌流盒，哺乳动物手术器械1套，静脉输液及中心静脉压测量装置1套，连接放血、储血装置1套，膀胱插管及计滴器装置1套； 注射器数支，试管2支，小烧杯1个，线绳（黑色、白色粗线)若干。 3％戊巴比妥钠，生理盐水，0.3％肝素，台氏液，中分子右旋糖苷，去甲肾上腺素，654-2，7.5%NaCl溶液，5%葡萄糖生理盐水。 【实验对象】 家兔 【实验方法和步骤】 一．动物准备和手术 1. 动物称重，麻醉，固定 正确捉拿家兔1只，称重，耳缘静脉缓慢注射3％戊巴比妥钠1ml/kg使动物麻醉，麻醉成功标准：四肢肌紧张减低，角膜反射消失，呼吸深而平稳。 将家兔仰卧于兔手术台上，固定四肢及头部。 2．颈部手术 剪去颈部正中的被毛，作长约5~7cm的正中切口，钝性分离皮下组织。颈部手术分离气管、右侧颈外静脉、左侧颈总动脉。依次进行： （1)气管插管 气管插管的一侧侧管连接呼吸流量换能器，记录呼吸。 （2)颈外静脉插管 目的是：①建立静脉输液或给药途径；②测量中心静脉压，当插管接近右心房，可见液面随呼吸而波动。插管完成后，慢速点滴生理盐水（5~10滴/min)，以保持插管的通畅以及维持尿的生成。 （3)左侧颈总动脉插管 通过“三通”连接血压传感器和放血用储血瓶。 3．下腹部手术 膀胱插管。请参照第三章相关内容。 4．全身血液肝素化 耳缘静注射肝素（625u/ml)，剂量为1ml/kg，此后每隔1h注射1ml维持。 5．连接BL-420E生物信号系统（见图6-6)， 1通道测量血压连接动脉插管压力换能器、2通道测量呼吸连接呼吸流量换能器、3通道作尿量计滴连接计滴器，分别调整适当的参数描记血压、呼吸和尿量。
图 6-6 兔失血性休克示意图 二．组织（微循环)血流观察项目及指标 1. 皮肤粘膜血管和尿量 观察球结合膜血管口径及血流；提起耳壳，对光透现血管口径及血流；用计滴器记录尿量，若家兔无尿，通过颈外静脉缓慢滴入少量生理盐水，使家兔尿量维持在6~8滴/min。 2. 正常家兔肠系膜微循环活体镜检观察 在左腹直肌旁作6cm纵行的切口腹壁，钝性分离肌肉；打开腹腔后，将卵圆孔外科肠钳伸入左下腹侧（紧贴前腹壁)；钳出一段小肠袢（一般是阑尾末端上8~12cm处的回肠袢)，平展并固定于恒温微循环灌流盒内，以38°C台氏液恒温灌流；用微循环显微镜连接BI2000医学图象分析系统，观察家兔小肠系膜微循环变化。 首先在镜下确认粗、细有别，血流方向相反的微动脉、微静脉和仅能让一个红细胞通过的毛细血管。微动脉的血流速度较快，静脉内血色较暗。然后，固定某一区域，连续观察毛细血管袢数目、血流速度、血流量及血管口径（可用测微器或专门仪器)改变。 三．复制失血性休克动物模型 观察记录正常血压、呼吸、尿量等指标和微循环血流的变化。复制失血性休克时，拨动“三通”停止输液，连通水检压计和静脉插管，可见水检压计的液面下降。当液面不再下降并随呼吸而波动，即为中心静脉压（CVP)，记录数据。分别进行： 1．少量失血 拨动连接动脉插管、压力换能器和储血瓶的“三通”，使血液（约10ml)从颈总动脉流入预先注有10ml 0.3％肝素的储血瓶，恢复“三通”原来的位置，观察皮肤粘膜、血压、呼吸、尿量和微循环的变化。（全血量按体重的8%计算，或70ml/kg，10ml血液约占血容量百分之几？)。 2. 大量失血：少量失血10分钟后，待家兔血压代偿性恢复正常，再打开“三通”，在3~5min（切勿过快)内让失血量达全血量20%~25%，观察上述指标的变化。要求血压下降至5.32kPa(40mmHg)左右，不应低于4kPa(30mmHg)。如果血压回升，可再放一定量的血。使整个观察期内血压始终维持在4~5.32kPa水平，即失血性休克状态。 两次失血后都应观察记录如下指标的变化： ⑴实验兔一般情况，皮肤粘膜、球（睑)结合膜血管口径及血流； ⑵CVP、BP、心率、呼吸、尿量； ⑶微循环的变化：大量失血后，毛细血管口径缩小，失血性休克持续一段时间后，毛细血管血流速度和血流量逐渐下降，部分微血管内（尤其在微静脉)可见白细胞附壁翻滚。 四．实验性治疗 根据失血性休克的病理生理变化，按休克发病学的防治原则（扩容、纠酸、应用血管活性药物和防治细胞损伤等)治疗，从下列药物中自行设计3种抢救方案（其中必须包括去甲肾上腺素)。药物可从静脉途径输入，观察并比较各项救治措施后血压、CVP和尿量等指标以及微循环的变化。 ⑴ 去甲肾上腺素：0.2mg溶于10ml生理盐水中，5min内静脉滴注； ⑵ 5％葡萄糖生理盐水（输液的量应根据失血量自行确定)； ⑶ 7.5%NaCl溶液（输入的量一般为失血量的1/3)； ⑷ 654-2：2mg溶于25ml生理盐水中，静脉滴注（20min输完)； ⑸ 中分子右旋糖苷：静脉滴入（输入的量应根据失血量自行确定)； ⑹ 0.01%异丙肾上腺素1ml，静脉注射； ⑺ 全血：将放出的血液经抗凝后全部倒入输液瓶内，快速输回。紧急情况下，可考虑经动脉逆行（向心脏方向)快速注入。 抢救治疗后，再复查动物一般情况，观察上述各项指标的变化。 五．处死动物 耳缘静脉注射空气5~10ml。 【实验注意事项】 1. 在整个实验过程中，均需保持动脉静脉插管与血管平行，以免刺破血管。 2. 保护耳缘静脉，注射时应先从耳远端进针，如不成功，再向耳根部移位。 3. 血管分离时要尽可能剔除脂肪和结缔组织。 4. 排空后的膀胱壁较厚，应选择血管最少的部位剪开插管，插管前一定要把膀胱壁各层（浆膜、肌层、粘膜下层和粘膜)剪破。 5. 本实验手术操作多，应尽量减少手术性出血和休克，如手术过程中失血过多时可先插颈外静脉输液。 6. 动脉插管前，要把家兔肝素化；插管前要把插管先充满肝素生理盐水，排出气泡；静脉插管一经插入，应立刻缓慢滴注生理盐水，以防凝血。输液量不能过多，以免导致肺水肿等合并症。 7. 正确旋转“三通”。 8. 先停止输液，再进行失血性的实验；在整个失血性实验过程，不再输液，观察中心静脉压的变化。 9. 注意分工合作，保持实验台面整洁。 【讨论思考题】 1. 讨论实验动物失血前、后各项指标变化的机理，什么证据说明家兔己发生了失血性休克？请阐明微循环处于什么阶段以及理由。 2. 根据实验所见指标能否完全阐明关于休克发生机制的现代理论？为什么？ 3. 在失血性休克中，血压的变化和微循环的变化是否一致？为什么？ 4. 抗休克药的作用机制是否相同？ 附：实验结果记录参考表（表6-6)。 表 6-6 失血性休克及其抢救过程中各项指标的变化 BP CVP 心 率 呼 吸 尿 量 耳朵结膜血管 (mmHg) (cmH2O) (次/min) 次/min 深度 （滴/min) 实验前 小量失血 大失血 NE 7.5%NaCl 输血 …
微循环观察及失血性休克 【实验目的】 1. 观察微循环以及在失血性休克的变化； 2. 复制失血性休克的动物模型，观察休克发生发展过程中血压和微循环血流等的变化，加深对于“休克发病的关键不在于血压，而在于血流”的理论认识。 3. 设计抢救方案，加深对休克防治原则及所用药物药理作用的理解，培养独立分析问题、解决问题的能力。 【实验原理】 微循环是指微动脉至微静脉之间的血液循环。典型的微循环由微动脉、后微动脉、毛细血管前括约肌、毛细血管网、直捷通路、动-静脉吻合支和微静脉等部分组成。按照微循环学说，休克发生的关键是微循环灌流障碍；根据病情进展，微循环变化可分为缺血性缺氧期、淤血性缺氧期和微循环衰竭期。 导致休克的原因有多种，其始动环节都是血容量急性降低、急性心泵功能障碍和血管容量迅速扩大。家兔的血容量可按体重（g)乘以8%来估算（ml)。急性出血，出血量在血容量的10%以下，机体通过代偿机制可不表现症状；出血量达20~30%，动物发生休克；出血量达50%，动物死亡。 失血性休克的临床表现是血压明显下降、皮肤苍白、四肢冰冷、尿量减少、中心静脉压下降, 此外还有心率、呼吸增快等。 抢救休克的原则是去除病因、扩容、纠酸、合理使用血管活性物质、使用药物保护细胞以及防止器官衰竭。据此，同学们可自行设计抢救方案。 【实验器材和药品】 BL-420E生理科学实验系统，兔手术台，压力换能器，呼吸流量换能器，BI2000医学图象分析系统，恒温灌流盒，哺乳动物手术器械1套，静脉输液及中心静脉压测量装置1套，连接放血、储血装置1套，膀胱插管及计滴器装置1套； 注射器数支，试管2支，小烧杯1个，线绳（黑色、白色粗线)若干。 3％戊巴比妥钠，生理盐水，0.3％肝素，台氏液，中分子右旋糖苷，去甲肾上腺素，654-2，7.5%NaCl溶液，5%葡萄糖生理盐水。 【实验对象】 家兔 【实验方法和步骤】 一．动物准备和手术 1. 动物称重，麻醉，固定 正确捉拿家兔1只，称重，耳缘静脉缓慢注射3％戊巴比妥钠1ml/kg使动物麻醉，麻醉成功标准：四肢肌紧张减低，角膜反射消失，呼吸深而平稳。 将家兔仰卧于兔手术台上，固定四肢及头部。 2．颈部手术 剪去颈部正中的被毛，作长约5~7cm的正中切口，钝性分离皮下组织。颈部手术分离气管、右侧颈外静脉、左侧颈总动脉。依次进行： （1)气管插管 气管插管的一侧侧管连接呼吸流量换能器，记录呼吸。 （2)颈外静脉插管 目的是：①建立静脉输液或给药途径；②测量中心静脉压，当插管接近右心房，可见液面随呼吸而波动。插管完成后，慢速点滴生理盐水（5~10滴/min)，以保持插管的通畅以及维持尿的生成。 （3)左侧颈总动脉插管 通过“三通”连接血压传感器和放血用储血瓶。 3．下腹部手术 膀胱插管。请参照第三章相关内容。 4．全身血液肝素化 耳缘静注射肝素（625u/ml)，剂量为1ml/kg，此后每隔1h注射1ml维持。 5．连接BL-420E生物信号系统（见图6-6)， 1通道测量血压连接动脉插管压力换能器、2通道测量呼吸连接呼吸流量换能器、3通道作尿量计滴连接计滴器，分别调整适当的参数描记血压、呼吸和尿量。
图 6-6 兔失血性休克示意图 二．组织（微循环)血流观察项目及指标 1. 皮肤粘膜血管和尿量 观察球结合膜血管口径及血流；提起耳壳，对光透现血管口径及血流；用计滴器记录尿量，若家兔无尿，通过颈外静脉缓慢滴入少量生理盐水，使家兔尿量维持在6~8滴/min。 2. 正常家兔肠系膜微循环活体镜检观察 在左腹直肌旁作6cm纵行的切口腹壁，钝性分离肌肉；打开腹腔后，将卵圆孔外科肠钳伸入左下腹侧（紧贴前腹壁)；钳出一段小肠袢（一般是阑尾末端上8~12cm处的回肠袢)，平展并固定于恒温微循环灌流盒内，以38°C台氏液恒温灌流；用微循环显微镜连接BI2000医学图象分析系统，观察家兔小肠系膜微循环变化。 首先在镜下确认粗、细有别，血流方向相反的微动脉、微静脉和仅能让一个红细胞通过的毛细血管。微动脉的血流速度较快，静脉内血色较暗。然后，固定某一区域，连续观察毛细血管袢数目、血流速度、血流量及血管口径（可用测微器或专门仪器)改变。 三．复制失血性休克动物模型 观察记录正常血压、呼吸、尿量等指标和微循环血流的变化。复制失血性休克时，拨动“三通”停止输液，连通水检压计和静脉插管，可见水检压计的液面下降。当液面不再下降并随呼吸而波动，即为中心静脉压（CVP)，记录数据。分别进行： 1．少量失血 拨动连接动脉插管、压力换能器和储血瓶的“三通”，使血液（约10ml)从颈总动脉流入预先注有10ml 0.3％肝素的储血瓶，恢复“三通”原来的位置，观察皮肤粘膜、血压、呼吸、尿量和微循环的变化。（全血量按体重的8%计算，或70ml/kg，10ml血液约占血容量百分之几？)。 2. 大量失血：少量失血10分钟后，待家兔血压代偿性恢复正常，再打开“三通”，在3~5min（切勿过快)内让失血量达全血量20%~25%，观察上述指标的变化。要求血压下降至5.32kPa(40mmHg)左右，不应低于4kPa(30mmHg)。如果血压回升，可再放一定量的血。使整个观察期内血压始终维持在4~5.32kPa水平，即失血性休克状态。 两次失血后都应观察记录如下指标的变化： ⑴实验兔一般情况，皮肤粘膜、球（睑)结合膜血管口径及血流； ⑵CVP、BP、心率、呼吸、尿量； ⑶微循环的变化：大量失血后，毛细血管口径缩小，失血性休克持续一段时间后，毛细血管血流速度和血流量逐渐下降，部分微血管内（尤其在微静脉)可见白细胞附壁翻滚。 四．实验性治疗 根据失血性休克的病理生理变化，按休克发病学的防治原则（扩容、纠酸、应用血管活性药物和防治细胞损伤等)治疗，从下列药物中自行设计3种抢救方案（其中必须包括去甲肾上腺素)。药物可从静脉途径输入，观察并比较各项救治措施后血压、CVP和尿量等指标以及微循环的变化。 ⑴ 去甲肾上腺素：0.2mg溶于10ml生理盐水中，5min内静脉滴注； ⑵ 5％葡萄糖生理盐水（输液的量应根据失血量自行确定)； ⑶ 7.5%NaCl溶液（输入的量一般为失血量的1/3)； ⑷ 654-2：2mg溶于25ml生理盐水中，静脉滴注（20min输完)； ⑸ 中分子右旋糖苷：静脉滴入（输入的量应根据失血量自行确定)； ⑹ 0.01%异丙肾上腺素1ml，静脉注射； ⑺ 全血：将放出的血液经抗凝后全部倒入输液瓶内，快速输回。紧急情况下，可考虑经动脉逆行（向心脏方向)快速注入。 抢救治疗后，再复查动物一般情况，观察上述各项指标的变化。 五．处死动物 耳缘静脉注射空气5~10ml。 【实验注意事项】 1. 在整个实验过程中，均需保持动脉静脉插管与血管平行，以免刺破血管。 2. 保护耳缘静脉，注射时应先从耳远端进针，如不成功，再向耳根部移位。 3. 血管分离时要尽可能剔除脂肪和结缔组织。 4. 排空后的膀胱壁较厚，应选择血管最少的部位剪开插管，插管前一定要把膀胱壁各层（浆膜、肌层、粘膜下层和粘膜)剪破。 5. 本实验手术操作多，应尽量减少手术性出血和休克，如手术过程中失血过多时可先插颈外静脉输液。 6. 动脉插管前，要把家兔肝素化；插管前要把插管先充满肝素生理盐水，排出气泡；静脉插管一经插入，应立刻缓慢滴注生理盐水，以防凝血。输液量不能过多，以免导致肺水肿等合并症。 7. 正确旋转“三通”。 8. 先停止输液，再进行失血性的实验；在整个失血性实验过程，不再输液，观察中心静脉压的变化。 9. 注意分工合作，保持实验台面整洁。 【讨论思考题】 1. 讨论实验动物失血前、后各项指标变化的机理，什么证据说明家兔己发生了失血性休克？请阐明微循环处于什么阶段以及理由。 2. 根据实验所见指标能否完全阐明关于休克发生机制的现代理论？为什么？ 3. 在失血性休克中，血压的变化和微循环的变化是否一致？为什么？ 4. 抗休克药的作用机制是否相同？ 附：实验结果记录参考表（表6-6)。 表 6-6 失血性休克及其抢救过程中各项指标的变化 BP CVP 心 率 呼 吸 尿 量 耳朵结膜血管 (mmHg) (cmH2O) (次/min) 次/min 深度 （滴/min) 实验前 小量失血 大失血 NE 7.5%NaCl 输血 …
(梁仲培) 心功能的影响因素与实验性心力衰竭 【实验目的】 1. 学习离体在位蟾蜍心脏的恒压灌流法，观察前、后负荷和心肌收缩性能对心功能的影响，并描绘心功能曲线的变化； 2. 制备实验性全心衰的动物模型；观察强心药物对衰竭心肌的治疗作用。 【实验原理】 一般作为衡量心功能的指标是心输出量（心输出量ml/min=每搏输出量ml/次×心率 次/min)。在此次实验中利用离体在位的蟾蜍心脏，消除了神经反射对心率变动的影响，所以相当于在心率基本恒定的情况下，主要考虑每搏输出量对心输出量的影响。前者反映了心肌舒缩力量与作功的大小，它受前、后负荷和心肌收缩性等基本因素的影响。在一定范围内，回心血量增加，心室舒张末期容积（前负荷)增加，使心肌纤维初长度拉长，心肌收缩力加强，每搏输出量增加，即F-Starling定律。当心室后负荷（如大动脉压)增加时，即心室收缩射血克服阻抗增加，心室壁收缩期张力增大，作功增加。心肌收缩性能改变是指心肌内在收缩机制改变所引起的收缩力量的改变，与前、后负荷无关，而可受去甲肾上腺素、乙酰胆碱等神经递质和体液因素的影响。改变心肌收缩性能可使心功曲线左移或右移。 本实验利用硫酸镉竞争性抑制Ca2+内流，降低心肌收缩性制备出全心衰模型。 洋地黄因使心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶活性减低，异丙肾上腺素则作为膜β受体激动剂，对衰竭心肌都有一定治疗作用，而普奈洛尔作为β受体阻断剂，可拮抗β受体激动剂的强心作用。 【实验器材与药品】 蛙类手术器械一套，恒压灌流装置一套，10ml量筒，小烧怀，动、静脉插管，计算，器滴管，坐标纸，任氏液，1:10,000去甲肾上腺素，1:10,000乙酰胆碱，2×10－6～2×10－5mol/L硫酸镉任氏液，0.2％地高辛，0.2%普奈洛尔（按片剂重量计算)，0.001%异丙肾上腺素。 【实验对象】 蟾蜍或蛙 【实验方法和步骤】 一.离体在位心脏灌流标本的制备 1. 破坏蛙脑和脊髓，将其仰卧放在蛙板上，用外科剪于剑突处向两侧锁骨肩峰端呈三角形剪开皮肤，用粗剪剪开胸壁，切勿损伤心脏，剪去胸骨、锁骨，用蛙钉把两前肢固定在蛙板上。用镊子提起心包膜，用眼科剪仔细将其剪开，暴露心脏。 2. 分离出左、右主动脉，在其下方穿两根线备用。用玻璃分针将心脏翻向头侧，可看到静脉窦与下腔静脉（后腔静脉)。小心分离并剪开与下腔静脉相连的心包膜组织在其下穿一根线备用。 将刚才穿于主动脉下的其中一根备用线从下腔静脉下绕过，结扎此线，便把两主动脉和下腔静脉以外的全部血管扎住，结扎过程中切勿扎到静脉窦。再把穿于主动脉下方的另一根线结扎右主动脉（见图6-7)。 3. 用镊子夹住下腔静脉的上壁少许，用剪刀沿镊子下缘剪一小口，将事先充满任氏液（不含气泡)的静脉插管插入此切口，直至静脉窦内，用备用线结扎固定。翻转心脏向下，提起左主动脉，在左主动脉尽量长的远端剪一斜形切口，然后用充满任氏液的吸管插入心室，冲洗并反复数次（目的是避免血液堵塞插管)。注意不要进气泡。 4、将事先充满任氏液的动脉插管向心性插入，作为心搏出口，并用线结扎固定。 5、把静脉插管与橡皮管1相连，但先不打开夹子；把动脉插管与橡皮管2相连（见图6-8)。
图 6-7 蛙心脏示意图（a、b、c分别为结扎线) 图 6-8 离体蛙心恒压灌流装置 二. 观察项目 1. 每分输出量和有效心功率的计算方法 （1)每分输出量：用小烧杯收集心脏搏出的灌流液1分钟，用小量筒测定搏出液量（ml)。同时计数心率（次/分)。 （2)计算： 有效心功率 = 心输出量 ′ 心功管高度（侧管高度)′ 水密度 （g×cm/min) （ml/min) （cm) （1g/ml) （3)肉眼观察心舒张容积、心肌收缩力量变化。 2. 观察实验因素对每分输出量和有效心功率的影响 （1)改变前负荷（后负荷固定)：把皮管2固定在约高于心脏3cm的水平，调节贮液瓶高度，使“零点”分别处于5cm、10cm、15cm……等高度，观察心舒容积和心肌收缩力量的变化，同时分别依次测定各高度下的心输出量、心率、每搏输出量并即时算出有效心功率。若有效心功率曲线平移时，便恢复“零点”在5cm的水平。找出最适前负荷（即心脏不过分充盈扩张而心输出量又较高的“零点”高度)。注意：“零点”在5cm时，搏出量应保持在20~30滴/分（在橡皮管1处用螺旋止水夹控制)。以下个项实验中所取的固定前负荷=最适前负荷-5cm。 （2)改变后负荷（前负荷固定)：把前负荷固定在“固定前负荷”，改变橡皮管2的高度（每次间距为5cm)观察并记录上述（1)中各项指标。 注意：在实验过程中，每改变一次侧管高度，要稳定1~2分钟，再进行测定。当侧管高度超过心脏代偿范围至有效心功率曲线平移或下降（即心衰)时，就不能再提高侧管高度。恢复皮管2约高于心脏3 cm水平，待心输出量基本达到本项实验前的水平并以此作为对照，进行以下的实验。（下面的各次实验也遵循此原则)。 （3)心肌收缩性能改变：将前后负荷固定，用滴管将1:10,000去甲肾上腺素1~2滴均匀滴加于心脏表面，待1~2min观察心率、心输出量和有效心功率的变化。用任氏液冲洗心脏表面，待心脏活动恢复后，按上法滴加1:10,000乙酰胆碱1~2滴滴于心脏表面，观察和记录上述指标的变化。 （4)异丙肾上腺素：用任氏液冲洗心脏表面，把乙酰胆碱冲洗干净，待心脏活动恢复后，用滴管将0.001%异丙肾上腺素1~2滴均匀滴加于心脏表面，待1~2min观察和记录心率、心输出量和有效心功率的变化。 （5)普奈洛尔：用任氏液冲洗心脏表面，待心脏活动恢复后，按上法滴加0.2%普奈洛尔2~3滴滴于心脏表面，观察和记录心率、心输出量和有效心功率的变化,待出现作用时，立即重复（4)步骤操作。 （6)硫酸镉：用任氏液冲洗心脏表面，待心脏活动恢复后，用2′10-6mol/L硫酸镉任氏液代替任氏液灌流心脏，观察和记录心率、心输出量和有效心功率的变化。 （7)强心甙药物：在用硫酸镉灌流的心脏出现心衰表现后（心输出量和有效心功率明显下降)，用滴管滴加0.2%毒毛旋花子素K（或0.2% 地戈辛)1~2滴于心脏表面，观察和记录心率、心输出量和有效心功率的变化。用任氏液冲洗心脏表面，待心脏活动恢复或接近给予强心甙药物前状态后，用滴管将0.001%异丙肾上腺素1~2滴均匀滴加于心脏表面，待1~2min观察和记录心率、心输出量和有效心功率的变化。 【实验注意事项】 1. 实验过程中勿用手捏拿心脏，以免损伤心脏。 2. 心脏表面应经常滴加任氏液，以保持湿润。 3. 整个实验过程中，管道不要扭曲。 4. 实验过程中，应回收、循环使用任氏液或硫酸镉任氏液。 【讨论思考题】 1. 评价心功能指标有哪些？各有何优缺点？ 2. 影响心功能的因素有哪些？从心脏本身来分析，那些因素可影响心功能？ 3. 强心苷对心脏有何作用？中毒表现如何？为什么？ 4. 临床上左、右心衰表现各如何？治疗原则及药物选择各如何？ 急性肝功能不全及氨在肝性脑病发病中的作用 【实验目的】 1. 急性阻断肝脏血流造成急性肝功能损伤模型，观察相关指标的变化； 2. 对经不同处理的实验家兔灌入氯化铵溶液或生理盐水，观察出现相应症状的所需的氯化铵用量，测定各组动物实验后的血氨水平，探讨氨在肝性脑病发病机制中的作用； 3. 通过各组动物的不同处理，进一步加深对医学研究设计的理解。 【实验原理】 正常情况下，肝细胞通过鸟氨酸循环把2个氨分子合成为1个尿素分子，再由肾脏排出体外，使血氨的来源和清除保持动态平衡。本实验人为地阻断肝脏的血流，造成肝细胞功能急性损伤，从而使谷丙转氨酶（GPT)活性升高，鸟氨酸循环障碍。 肝性脑病是继发于严重肝功能损害的精神神经综合症。关于其发病机制尚未完全阐明。目前有氨中毒学说、假性神经介质学说、血浆氨基酸失衡学说、g-GABA学说和综合学说等。氨中毒学说中心内容是肝性脑病的发生与血氨升高密切相关。本实验在人为地阻断肝脏的血流、造成肝功能急性损伤的同时，再经消化道灌入复方氯化铵溶液，使血氨水平明显升高，产生类似肝性脑病的临床表现。 【实验器材和药品】 哺乳动物手术器械1套，兔台，胃管（用人的导尿管代替)，粗棉线1根，三角缝针和小圆针各1根，血氨测定用的器材1套；5ml试管10支，离心机，恒温水浴箱，722型分光光度计； 1%普鲁卡因，0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4), 谷丙转氨酶底物溶液, 2,4-二硝基苯肼溶液，0.4mmol/L NaOH溶液, 丙酮酸标准液(2mmol/ml)； 2.5%复方氯化铵溶液（5%葡萄糖溶液100ml中加入氯化铵2.5g，碳酸氢钠1.5g)，生理盐水，无氨水； 10%钨酸钠，硫酸铵标准液，0.5mmol/L硫酸，显色Ⅰ液，显色Ⅱ液；（供血滤液直接测定血氨法用，若用血氨测定试剂盒则不必准备)； 血氨测定试剂盒，尿素测定试剂盒。 【实验对象】 家兔 【实验方法和步骤】 一．从耳中央动脉取血制备血清 将家兔置于兔固定箱内，在兔耳的中央有一条较粗、颜色较鲜红的中央动脉，用左手固定兔耳，右手取注射器，在中央动脉的末端，沿着动脉平行地向心方向刺入动脉，即可见动脉血进入针筒，取血3ml制备血清备用。取血完毕后注意止血。由于兔耳中央动脉容易痉挛，故抽血前必须让兔耳充分充血，采血时动作要迅速。采血所用针头不要太细，一般用6号针头。 二．急性肝功能不全动物模型的制备及分组 1. 手术 取家兔3只，进行如下操作： ⑴ 将家兔称重后，固定于兔台上。剪去上腹部被毛，在正中切口部位用0.1%普鲁卡因5ml作皮下浸润麻醉；切开皮肤，长约5~6cm；再沿腹白线切开腹壁进入腹腔，可见肝等内脏。 ⑵ 结扎肝门区血管：用手轻压肝表面，在肝和膈肌之间可见一透明、呈三角形的镰状韧带。小心用眼科剪将其剪断（切莫损伤膈肌)。 ⑶ 将3只家兔分为甲、乙、丙3组。甲和丙组把粗棉线放置于家兔肝门区，除右外叶和尾叶外，将肝左外侧叶、左中叶和右中叶翻出并用力结扎。使大部分肝血流阻断，因而模拟急性肝功能不全。乙兔不结扎肝叶，肝功能正常。 ⑷ 十二指肠插管：沿胃幽门向下找出一段十二指肠，用带有丝线的小圆针穿越肠壁4～5针，围成一个小圆圈。再用眼科剪在圆圈内血管少的肠壁作一小切口，将胃管顺十二指肠远端方向插入肠腔5cm。结扎并固定胃管后，用三角缝针将腹壁做连锁缝合，关闭腹壁，把家兔松开。 2. 实验观察 观察家兔的一般状况、呼吸、肌张力、角膜反射和痛觉反射等指标后，小肠插管家兔小肠内每隔5min灌入如下溶液：甲和乙兔灌入2.5%复方氯化铵溶液3ml/kg；丙兔灌入生理盐水3ml/kg。每次灌药前观察上述指标的变化。 甲兔灌入复方氯化铵溶液后呼吸逐渐变得深快或深大，肌张力减弱、颈软、头垂、四肢无力、痛觉反射和角膜反射迟钝，灌药5~6次左右，甲兔痉挛抽搐、角弓反张。请实验者一边观察，一边思考症状为什么会出现。 三. 谷丙转氨酶、血氨和尿素氮的检测 在甲兔第一次痉挛抽搐发作时，固定甲兔于兔台上，先从耳中央动脉取血3ml制备血清备用；再用抗凝注射器心脏采血5ml，作血氨和尿素氮（BUN)的测定。 1. 按附录的方法测定家兔实验前后血清谷丙转氨酶（GPT)的活力。 2. 血氨和血尿素氮（BUN)的测定：分别按试剂盒方法或附录的方法测定血氨（1ml)和血尿素氮。 其它组家兔按甲兔出现痉挛抽搐的时间进行用上述方法取血，测定GPT活力、血氨和BUN。 注：各组家兔都做谷丙转氨酶和血氨的测定；由于测定血浆BUN条件要求较高，甲、乙、丙兔可各选一组家兔进行血浆BUN测定（方法参照试剂盒进行)。 【实验注意事项】 1. 游离肝脏和剪破镰状韧带的动作准确、轻柔，以免肝叶破裂出血和损伤膈肌造成气胸；结扎肝脏时，粗棉线要置于肝叶根部避免勒破肝脏，要用力结扎，阻断肝脏的血液供应。 2. 心脏取血方法可参照附录或第三章相关内容。注射器要肝素化并干燥，以免溶血；入针部位要准确，垂直进针，深度适当；动作要轻柔、迅速，尽可能缩短针头在心脏停留的时间，防止凝血；针头进入胸壁后不能左右摆动，以免损伤心、肺。 3. 血氨的测定可按照试剂盒提供的方法进行或参照附录的血滤液直接测定法进行。 4．尿素氮的测定要按照试剂盒提供的方法进行。 【讨论思考题】 1. 结扎肝门血管以及灌入氯化铵是否复制肝性脑病的动物模型？为什么？ 2. 为什么要设立甲、乙、丙兔，作用何在？ 3. 灌入复方氯化铵溶液后，甲兔的呼吸如何变化？为什么？ 4. 哪些指标说明肝功能损伤? 它们之间有何关系？道理何在？ 5. 氯化铵在哪些方面对CNS起作用？ 6. 根据氨中毒学说和上面的实验结果推理，现设计一组小鼠实验方案，给药剂量和分组见表6-13。 表中5只小鼠腹腔注入不同试剂后会出现什么表现？小鼠可能发生死亡的次序是什么？本实验说明什么问题？ 表 6-13 小鼠氨中毒的实验设计 鼠号 | 十二指肠或腹腔注射试剂 | 剂量 | 死亡次序 | 1 | 0.85%NaCl溶液 | 0.4ml/10g体重 | | 2 | 2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g体重 | | 3 | 0.5%醋酸，2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g体重 | | 4 | 2.5%NH4Cl, 1.5%NaHCO3溶液 | 0.4ml/10g体重 | | 5 | 50%谷氨酸钠，2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g体重 | |
【附录】 1．心脏取血：家兔的心脏在胸骨后正中央，约在第三至第五肋间。取血时，将家兔仰卧，在第三肋间胸骨左缘（两前肢下缘连线与胸骨左缘交界)3mm处，或以左手拇指在胸骨一侧，食指及中指于胸骨另侧固定心脏，在心尖搏动最明显处将采血针与胸壁垂直刺入胸腔内约2.5~3cm，当持针手感到心脏搏动时，再稍刺入即入心腔。然后抽出血液。取血时，针头宜直入直出，勿在胸腔内左右探索。 2．谷丙转氨酶（GPT)活性测定（赖氏法) GPT催化L-丙氨酸和a-酮戊二酸的反应，生成丙酮酸和L-谷氨酸。一般以在一定的时间内生成的丙酮酸多少确定GPT活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼反应生成黄色的丙酮酸-2,4二硝基苯肼，在碱性溶液中呈棕红色。颜色的深浅与丙酮酸的量成正比。可通过同样处理的丙酮酸标准液比较，算出GPT的活力。具体方法如下： ⑴ 标准曲线的制备（实验前准备)：取试管6支，按表6-14操作 表 6-14 丙酮酸标准曲线制作的步骤 加入物（ml) | 空白管 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 丙酮酸标准液(2mmol/L) | 0 | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 | 谷丙转氨酶底物溶液 | 0.50 | 0.45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 | 0.25 | 37°C水浴预温5min | 2,4-二硝基苯肼溶液 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 37°C水浴预温20min | 0.4mol/L NaOH溶液 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 丙酮酸实际含量(mmol) | 0 | 0.10 | 0.20 | 0.30 | 0.40 | 0.50 | 相当于GPT活力单位 | 0 | 28 | 57 | 97 | 150 | 200 |
加入0.4mol/L NaOH溶液后混匀，10分钟后在520nm波长下比色，以空白管调零，读取各管的吸光度。以吸光度与活力单位绘制标准曲线。 ⑵ 血清GPT活力测定：取试管2支，按表6-15操作。 表 6-15 血清GPT活力测定步骤 加入物（ml) | 测定管 | 对照管 | 谷丙转氨酶底物溶液 | 0.50 | - | 37°C水浴预温5min | 血清 | 0.10 | 0.10 | 摇匀，37°C水浴，准确保温30min | 2,4-二硝基苯肼溶液 | 0.50 | 0.50 | 谷丙转氨酶底物溶液 | - | 0.50 | 摇匀，37°C水浴，保温20min | 0.4mol/L NaOH溶液 | 5.0 | 5.0 |
混匀,静置10min后，用蒸馏水调零,在520nm波长比色.测定管吸光度减去对照管吸光度后，从标准曲线上查出酶活力单位。 3. 氨定量测定--血滤液直接测定血氨方法 取试管3支，分别标为测定管（u)、标准管（s)和空白管（b)，严格按下表的顺序先加入10%钨酸钠1ml，再分别加入全血1ml、硫酸铵标准液1ml、无氨水1ml，用小玻棒混匀，再加入0.5mol/L硫酸1ml，混匀。见表6-16。 表 6-16 氨定量测定步骤 | 测定（u)ml | 标准（s)ml | 空白（b)ml | 10%钨酸钠 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 全血 | 1.0 | / | / | 硫酸铵标准液 | / | 1.0 | / | 无氨水 | / | / | 1.0 | 0.5mol/L硫酸 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
混匀后，离心沉淀（1500~2000转′10分钟)。 另取试管3支按表6-17操作。 表 6-17 血氨测定显色步骤 | 测定（u)ml | 标准（s)ml | 空白（b)ml | 上清液 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 显色Ⅰ液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 显色Ⅱ液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
混匀后，置37°C水浴中20分钟。然后用722分光光度计以620nm波长比色，空白调零。血氨计算：Du/Ds=血氨氮（mg/L)。 （注：我们用该法测定46只健康家兔空腹血氨水平为1.23±0.47mg/L)。 4．应用试剂盒测定血氨按试剂盒提供的方法进行。 5．血尿素氮测定按试剂盒上的方法进行。 6．实验结果可参考表6-18记录： 表 6-18 各组家兔症状及GPT、血氨、尿素氮的变化 组别 | 症状 | 剂量 | GPT（IU) | 血氨(mg/L) | 血BUN(mg/L) | | 呼吸深快 | 肌无力 | 抽搐 | （ml/kg) | 实验前 | 实验后 | 实验前 | 实验后 | 实验前 | 实验后 | 甲 | | | | | | | 1．23 ±0.47 | | 280±98 | | 乙 | | | | | | | | | 丙 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
注: 家兔实验前血BUN数据引自南京医科大学病理生理学教研室。 | 
