病原生物学-实验指导:医学微生物学 实验指导

医学微生物学指导

（供医学、检验、影像、口腔、麻醉、预防等专业使用)

广州医科大学病原生物学教研室

目  录

实验目的与要求--------------------------------------------------------------------------2

实验室规则--------------------------------------------------------------------------------2

实验一  细菌形态结构和细菌的接种培养-----------------------------------------3

实验二  细菌的分布和变异-----------------------------------------------------------9

实验三  消毒灭菌和细菌的致病性-------------------------------------------------11

实验四  病毒的形态和检查法-------------------------------------------------------21

实验五  呼吸道感染的细菌----------------------------------------------------------30

实验六  消化道感染的细菌(1)------------------------------------------------------33

实验七  消化道感染的细菌(2)------------------------------------------------------33

实验八  创伤感染的细菌-------------------------------------------------------------37

实验九  性感染和输血感染的微生物----------------------------------------------40

实验十  真菌实验----------------------------------------------------------------------45

附录一  染色液及染色法-------------------------------------------------------------48

附录二  试剂及溶液-------------------------------------------------------------------50

附录三  常用培养基制备-------------------------------------------------------------51

附录四  真菌小培养法----------------------------------------------------------------56

实验目的和要求

医学微生物学实验是医学微生物学的重要组成部分，是医学微生物学教学过程中的重要环节之一，是理论与实验研究的技术基础。

通过实验，加深、巩固对理论内容的理解与记忆；学习、掌握有关医学微生物学的基本操作技术，树立无菌操作观念；更重要的是通过实验培养实事求是的科学的态度和独立分析问题与解决问题的能力。为对有关疾病的诊断与防治，对医学微生物学的科学研究工作所必要的实验方法与技术打下一定的基础。特别是通过实验，使学生熟练地掌握普通光学显微镜、涂片染色、分离接种与稀释方法等基本操作技术。

实验形式分教师示教和学生操作两种。前者主要验证理论，后者可从不同角度进行基本技术训练和反复练习，掌握基本技能。

为了提高实验课效果，保证实验课质量，要求学生做到：

⒈实验前必须做好预习，以了解实验的内容、目的、理论依据、操作方法及注意事项，避免或减少错误的发生。

⒉实验过程中坚持严肃性，严格性与严密性，对操作的实验要在全面理解的基础上，按步骤依次进行操作，并进行积极地思考；对示教内容要仔细观察并与有关理论密切联系。

⒊如实记录，分析结果，得出结论。如结果与理论不符，应尽量分析，探讨起原因以培养训练自己的思维能力，最后写出实验报告。

实验室规则

实验中所用材料，多具有传染性（如病原微生物、含病原微生物的患者血、尿、便、痰、脓汁及感染动物等)，在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，防止实验室感染，防止病原微生物污染环境。必须遵守以下各项。

一、进实验室应穿白大衣，不得将书包、衣物等放在实验台上，不必需的物品勿携入室内。

二、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签等。

三、保持实验室安静，实验进行时不准随意进出。实验室中物品未经许可不准带出室外。

四、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。

⒈吸入活菌液，应立即吐入容器中消毒，并用1：1000过猛酸甲溶液或3%双氧水漱口，必要时根据菌类的不同服用适当的抗菌药物。

⒉菌液流洒桌面或地面，倾注2—3%来苏儿或0.1%新洁尔灭于污染面上，30分钟后抹去。手上污染活菌，在上述消毒液中浸泡10—20分钟后，再以肥皂水刷洗。衣服污染时，用上述消毒液浸泡30分钟后，或高压灭菌后清洗。

五、实验用过的吸管、平皿、毛细管及玻片等应立即放入指定的回收桶中，不准在实验台上乱放。接种环和接种针等用后应立即于酒精灯火焰上烧灼灭菌。

六、实验完毕，应及时清理实验台，值日生负责实验室清洁并将回收桶及实验动物送回消毒室。

实验一   细菌形态结构和接种培养

一、细菌的形态和结构

（一)实验目的与原理

1．认识与记忆细菌的基本形态及特殊结构特点。

各种细菌在一定条件下，均维持一定的形态和结构。细菌的形态与结构是鉴别细菌种类的根据之一，细菌结构又与其致病性强弱，免疫发生机理均有一定关系。

（二)实验材料

１、显微镜

２、观察标本

（１)球菌、葡萄球菌、链球菌、卡他球菌涂片标本

（２)杆菌：大肠杆菌涂片标本

（３)弧菌：霍乱弧菌涂片标本

（４)荚膜：肺炎双球菌或产气荚膜荚膜杆菌涂片标本

（５)鞭毛：伤寒杆菌或变形杆菌鞭毛标本

（６)芽胞：破伤风杆菌芽胞标本

（三)实验方法与结果

在玻片标本的正面，滴加镜油，用油镜观察。

１、注意观察细菌基本形态（１、２、３、号标本)，比较其形状、大小排列及染色性。

２、注意六别细菌特殊结构。

（１)观察４号标本荚膜的特点，如大小、颜色与菌体的关系。

（２)观察５号标本鞭毛的特点，如鞭毛的形态，数目及其位置。

（３)观察６号标本芽胞，注意芽胞的形状、颜色及位置。

３、左眼观察标本的同时，右眼将图画在实验报告纸上，并加以适当地描述。

（四)实验报告

图示细菌基本形态及特殊结构，并加以适当描述。

二、细菌动力显微镜检查法

细菌鞭毛与其动力有关，有无鞭毛，细菌的运动方式不同，依其运动特点可间接有判定细菌有无鞭毛，也是鉴定细菌方法之一。证明细菌有无鞭毛，除显微镜直接观察其运动特点外，还可以通过鞭毛染色法直接观察有无鞭毛及其特点，也可以通过半固体穿刺培养法间接证明。本实验介绍的方法中，以压滴法最简单，较为常见。

（一)实验目的与原理

了解细菌动力的显微镜检查法，观察有鞭毛与无鞭毛菌运动的特点。

有鞭毛的细菌运动称真正运动叫固有运动，其特点是细菌从一个地方游到另一个地方，可以改变位置，无鞭毛的细菌运动叫布朗运动，特点是，不能改变位置，只在局部闪动，是因液体分子的冲击，致使细菌在局部颤动，这种运动也称分子运动。

（二)实验方法及实验结果

（一)悬滴法

１、材料

（１)菌种：变形杆菌、葡萄球菌８－１２小时幼龄培养物。

（２)凹玻片、盖玻片、凡士林。

（３)显微镜

图1 悬滴法（正面及侧面)

２、方法

（１)取洁净凹面玻片一张，在凹窝周围涂以凡士林（图２)

（２)取一环变形杆菌或葡萄坏菌培养物，放于干净的盖玻片中央。

（３)将涂凡士林的凹面载物片反转（凹向下)，凹窝对准盖玻片的菌液滴置于其上，粘住盖玻片后再反转凹面载片（此时液滴悬于盖玻片下)用接种环柄轻压盖片周围，使与凹窝边缘粘紧。

（４)凹面载片置于镜台上，先以低倍物镜观察（聚光器下降，使视野稍暗)找到液滴边缘后，将边缘移到视野中央，再换高倍物镜观察，上下转动微螺旋，即可看到在较暗的视野中有反光较强的闪动或流动的菌体。

３、结果

变形杆菌有鞭毛，有改变位置的运动，即真正运动。

葡萄坏菌无鞭毛，只在局部闪动，即布郎运动。

三、 细菌的革兰染色标本检查法

形态学检查是鉴定细菌的重要一环。但细菌个体小，无色透明，不染色在镜下不易观察清晰，使菌体着色后，即可在镜下清晰地观察其形态特征，有助于菌种的鉴定。进行细菌染色时因共等电点低（PH2~5)，常用美兰、复红、结晶紫等碱性染料，易于着色。染色方法有单染色与复染色之分只用一种染料使细菌着色的方法称单染色法，用二种以上染料染色的方法叫复染色法，主要有革兰氏染色法、抗酸染色法，此外还有多种特殊染色法。

（一)实验目的与原理

掌握细菌涂片标本的制备法及革兰氏染色方法。

革兰氏染色原理尚未完全明了，可能与下述三个方面有关：

（1)革兰氏阳性菌等电点（PH2~3)比阴性菌等电点（PH4~5)低，一般染色时深液的酸硷度在PH7.0左右，故阳性菌较阴性菌带有较多的阴电荷，与硷性染料结合力较强，结合的染料较多，不易脱色。（2)革兰氏阳性菌细胞内有某种特殊的化学万分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料——媒染剂复合物相结合，使已着色的细菌不易脱色。（3)革兰氏阳性菌细胞壁通透性低，脱色剂（酒精)较易通过革兰氏阴性菌的细胞壁，将碘和染料的复合物溶解洗出，容易脱色，阳性菌则不易脱色，保留了紫色。

（二)实验材料

1、菌种：大肠杆菌和葡萄球菌的混合液。

2、染液：革兰氏染色液

3、显微镜、载物玻片及接种环等

（三)实验方法

1、染色涂片制备法：涂片厚薄适度，否则效果不好。

（1)涂片：取洁净载物玻片一张，点燃酒精灯，左手持菌液试管右手以持手笔方式拿接种环，在火焰外焰中烧灼灭菌后取混合菌液一环，轻轻涂布于玻片的偏中央，涂布范围直径1厘米左右，厚度适宜均匀（以透过涂面能看清字迹为宜)。接种环于火焰上再次烧灼灭菌后放还原处。

（2)干燥：涂片最好在空气中自然干燥，如欲加速干燥，可将涂面向上，距火焰稍远处烘干，切忌紧靠火焰，以防菌体变形，无法观察。

（3)固定：涂片干燥后，涂面向上在火焰最热部分往返通过三次（一般钟摆速度)即可。固定的目的是杀死细菌，使菌体蛋白凝固与玻片粘附较牢；改变对染料的通透性（一般染料难于进入活细胞内)容易着色。

2、革兰氏染色法

①初染：在已固定好的涂片上滴加结晶紫液1—2滴（以盖满涂面为度)，染1分钟后，用水轻轻冲洗。

②媒染：革兰氏碘液1—2滴，作用1分钟后，水洗。

③脱色：滴加95%酒精2—3滴，轻轻侧动玻片（以助脱色)，使酒精流去，再滴加酒精，如此反复，直到流下的酒精无色或呈淡紫色为止，水洗。

④复染：滴加稀释复红1—2滴，染色1分钟，水洗。

⑤待干或用滤纸吸干（一定要吸干！)用油镜观察。

3、实验报告：绘图并进行分析。

四、 细菌的接种

（一)细菌分离培养接种法——平板划线分离培养法

自然界中，病人被检材料（痰、便、脓汁及病灶)中常有多种细菌混杂在一起，欲证明材料中有无某种细菌存在或专门研究其中某一种细菌时，必须先使各种细菌分散开后，方能获得某种单一细菌的培养物，这种技术称为分离培养接种技术。方法有多种；如平板划线法，平板倾注法及动物接种分离法等，前者最为多用。

1、实验目的与原理

初步练习平板划线分离细菌的方法。使用混杂在一起的细菌分散生长。

将粘有混杂菌材料的接种环，从平板培养基表面的一点开始反复而不重叠地划线，随着划线的延长，接种环上粘有的细菌逐渐减少，至划线的最后部分细菌可单个地留在培养基上生长繁殖，形成单个菌落。

2、实验材料

（1)菌种：白色葡萄球菌和大肠杆菌的混合液。

（2)普通琼脂平板培养基，接种环等。

3、实验方法

（1)右手持接种环在火焰上灭菌待冷（约2~5秒钟)取一环菌液。

（2)左手抓握平板培养基，微开皿盖，伸入接种环将材料涂于培养基“甲”部（图2—1，2—2)。

图2-1平板区划线法 图2-2陪养后菌落的散布情况

（3)烧灼接种环冷却后，通过“甲”部左右反复划线（不重叠)并向下移，至培养基一半的地方如图“乙”部。

（4)再烧灼接种环待冷，将培养基逆时针转90度，接种环通过“乙”部，再划线至培养基所余的一半，如图“丙”部。

（5)如上法灭菌，将培养基再逆时针转90度，通过“丙”部反复划线，划完最后的“丁”部。

（6)划完，盖好皿盖，并在皿底部贴好标签，说明接种者班组、姓名，培养皿倒置，送温箱中培养。

（7)37℃24小时后取出，观察菌落的大小、形状、边缘、表面结构、颜色、透明度等性状。

（二)细菌纯培养接种法

细菌分离成纯种培养后，常需接种至各种有关培养基，以进一步测试其生化瓜等生物学性状。根据培养基的物理状态不同，纯种接种法有斜面培养基接种、液体培养基接种和穿刺接种法三种。

1、 斜面培养基接种法；主要用于纯培养及保存菌种。

（1)实验材料：

①菌种：大肠杆菌和白色葡萄球菌18~24小时液体培养物。

②培养基：琼脂斜面培养基。

   （2)实验方法：

图3  斜面培养基接种法

①左手拇指、食指、中指及无名指握住菌种管或待接种的培养基管使菌种管底部，斜面向上。

②右手持接种环，烧灼灭菌，柄部也要迅速通过火焰2~3次杀灭表面的杂菌，灭菌后拿在手中，勿与其它物接触。

④以右手小指和小鱼际肌拔取菌种管或待接种管橡皮塞，管口迅速通过火焰灭菌。

⑤用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管取菌一环。自待接种管斜面底部轻轻向上部蜿蜒划线或在斜面作上下涂布（勿触破培养基表面，沾菌的接种环进出试管时不应触及试管内壁和管口)。

⑥接种毕，接种环火焰灭菌后放下。管口迅速通过火焰2~3次灭菌并塞上橡皮塞，将管放回原处。

⑦37℃孵育18~24小时，观察生长情况。

2、 液体培养基接种法：主要用于增菌培养及检测细菌的生化反应。

（1)实验材料：

①菌种：大肠杆菌18~24小时斜面培养物。

②培养基：肉汤培养基。

（2)实验方法

①如斜面培养基接种法，左手握持菌种管或待接种管。

②接种环火焰灭菌，伸入菌种管取少量菌苔，再伸入肉汤管中在接近上面液面管壁上轻轻研磨（图4)并沾取少许肉汤调和，使菌混于肉汤中。

③接种毕，接种环灭菌后放下。分别塞好橡皮塞（方法同前)37℃孵育18~24小时，观察生长情况。

图4  液体培养基接种法

3、半固体培养基接种法

制成呈柱形直立于试管中的半固体培养基，应用穿刺法接种。

（1)实验材料

①菌种：大肠杆菌及白色葡萄球菌18~24小时斜面培养物。

②培养基：半固体琼脂培养基

③接种针

（2)实验方法

①左手握持菌种管或待接种管（方法同前)

②右手持接种针火焰灭菌，挑取少许菌苔，于待接种培养基中心垂直插入（图5)近管底处，然后转动接种针原路退出。

图5  半固体培养基接种方法

③接种毕，接种针灭菌后放下，分别塞好橡皮塞。37℃孵育18~24小时，观察有无细菌生长，细菌有无动力。

（四)实验报告

记录普通琼脂平板、斜面、半固体培养基和液体培养基的培养结果。说明有何实际意义。

实验二   细菌的分布和变异

  一、细菌的分布

（一)自然沉降法――检查空气中的细菌

    1．实验材料：普通琼脂平板。

2．实验方法：

取普通琼脂平板一个，打开皿盖，让培养基直接暴露于空气中，置于实验台上或需要测定的地方10分钟。盖上皿盖，用记号笔或蜡笔作标记，放入37℃温箱培养18~24小时，观察细菌的生长情况和数量。并分析其意义。

（二)手指皮肤表面的细菌检查――涂抹法

    1．实验材料：普通琼脂平板。

2．实验方法：

取普通琼脂平板一个，在平板底面用记号笔或蜡笔将平板分成若干等份，于每份培养基表面分别用手指轻轻涂抹（不要擦破培养基)。盖上皿盖,分别标记清楚。置37℃温箱培养18~24小时观察结果。观察细菌的数量及种类，并分析其意义。

   【注意事项】

本实验检出的除细菌外，尚可能有真菌、放线菌等，请注意加以区别。

 （三)人咽喉部位的细菌检查

1．实验材料：血液琼脂平板。

2．实验方法：

   取血液琼脂平板一个，打开皿盖，将培养基面置于口腔前约10厘米处，用力咳嗽数次（让飞沫落在培养基表面)，然后盖上皿盖。置37℃培养18~24小时观察结果。观察细菌的数量、种类等，注意是否有溶血环，并分析其意义。

二、细菌的变异

由于细菌结构简单、繁殖迅速，易受环境条件影响而发生变异。正因为有了变异性， 细菌才会有所发展，产生变种和新种。

细菌的形态变异

    应用人工的方法，可以导致细菌的形态变异。如将鼠疫杆菌培养于含盐的培养基中， 能使其变异成大小不等的多形态。

(一)材料：

1、菌种：鼠疫耶尔森氏菌(无毒株)斜面24小时培养物；

2、载玻片、革兰氏染液、3—6％氯化钠血液琼脂培养基。

(二)方法：

1、接种无毒鼠疫耶尔森氏菌于3—6％氯化钠血液琼脂斜面上。  

2、28—30℃孵育3天，取出作涂片，革兰氏染色后在镜下与未变异前的涂片作比较观察。

细菌菌落变异

光滑型→粗糙型菌落变异，是细菌的—个全面性的变异，不仅其菌落外形不同，在液 体培养基中的生长情况、生化反应能力、抗原性及致病性等都会发生改变。

一)材料：

1、菌种：光滑型、粗糙型痢疾志贺氏菌琼脂斜面18—24小时培养物；

2、琼脂平板、肉汤培养基。

(二)方法：

1、分别接种光滑型及粗糙型痢疾志贺氏菌于两个琼脂平板上和两管肉汤中。

2、37℃孵育24小时后，比较观察两型的菌落特征及在液体培养基中的生长情况。  

细菌鞭毛的变异   

若在培养基中加人0.1％的石炭酸，变形杆菌鞭毛的形成就会受抑制。有鞭毛的变形杆菌，动力非常活泼，在普通培养基可形成特殊的迁徒生长现象(即是从接种处向四周扩散生长)，失去鞭毛者，则无此现象。

(一)材料：

1、  菌种：普通变形杆菌琼脂斜面18—24小时培养物；

2、  琼脂平板、0.1％石炭酸琼脂平板培养基。

(二)方法：

1、分别在琼脂平板和0.1％石炭酸琼脂平板的一侧点种变形杆菌，勿将细菌划分开。

2、37℃孵育24小时后，观察有无迁徒现象。

 细菌的耐药性变异—R因子传递试验

大肠埃希氏菌与痢疾志贺氏菌的新陈代谢不同，前者能分解乳糖产酸，在S．S．培养 基中使指示剂(中性红)显色，故菌落呈粉红色，不透明。痢疾志贺氏菌不能分解乳糖，因而在S．S．平板上菌落为无色半透明。若将耐链霉素的大肠埃希氏菌与链霉素敏感的痢疾志贺氏菌共同孵育，则大肠埃希氏菌可因与痢疾志贺氏菌直接接触，通过接合使R因子将耐药性传递，可使痢疾志贺氏菌获得耐链霉素的特性。耐链霉素的痢疾志贺氏菌可在含链霉素的平板上生长繁殖，表现为半透明无色菌落。对这类菌落还需按肠道杆菌必要的鉴定步骤予以鉴定，以明确其是否为耐药菌株。

(一)材料：

1、菌株：耐链霉素的大肠埃希氏菌菌株，对链霉素敏感的福氏痢疾志贺氏菌菌株；

2、培养基：普通肉汤培养基，含100p．g链霉素／毫升的S．S．平板；S．S．平板；

3、无菌吸管，无菌试管，无菌棉拭子等。

(二)方法：

l、将耐药的大肠埃希氏菌与敏感的福氏痢疾志贺氏菌分别移种到两支肉汤培养基中，培养12小时。

2、吸取1份大肠埃希氏菌培养液加4份痢疾志贺氏茵培养液混合于一无菌试管中； 37℃30分钟至1小时。 

3、用无菌棉拭子沾取上述混合菌液涂布于含100μg／ml链霉素的s.s平板上，同时分别接种福氏痢疾志贺氏菌和大肠杆菌于s.s平板与含链霉素的s.s平板上，37℃培养18—24小时后，观察菌落情况。

实验三   外界因素对细菌的影响

  物理因素对细菌的影响

许多物理因素如温度、干燥、紫外线、电离辐射和声波等均可导致细菌生长繁殖的抑 制、杀灭或变异。本次实验主要观察热力和紫外线对细菌的杀灭作用，并了解滤菌器的除 菌方法。

一、细菌对热的抵抗力

   (一)材料：

大肠埃希氏菌肉汤培养物、枯草杆菌肉汤培养物、小管肉汤、温度计、烧杯、三脚架、泥三角。

(二)方法：

1、先用酒精灯把烧杯内的水加热煮沸备用。  

2、用接种环各取大肠埃希氏菌三环接种于两管肉汤中，同法接种枯草杆菌到另外两 管肉汤中。

3、取已接种大肠埃希氏菌、枯草杆菌的肉汤各一管作为试验组，放人盛有沸水的烧杯 中，继续加热维持沸腾5分钟；然后取出，迅速放人冷水中冷却，并作好标记。

4、余下的接种了大肠埃希氏菌、枯草杆菌的肉汤各一管；不加热处理，作为对照组(做 好标记)。 

5、最后将试验组及对照组肉汤管放37℃温箱中，孵育24小时后有无细菌生长，从实验结果中比较不产芽胞的大肠埃希氏菌与产芽胞的枯草杆菌对热的抵抗能力。

  注意事项：

(1)接种前，应先将枯草杆菌肉汤培养物充分摇匀，使菌膜破碎、细菌分散，然后取菌。  (2)试验组需在试管塞上作适当标记，而不宜在试管壁上用蜡笔做标记，以防加热后标记模糊不清。

(3)加热时间需严格掌握，水沸后才将两支试管放人，烧杯口的空隙用玻片盖住，煮沸 维持5分钟即行取出并迅速置冷水中冷却。  

二、紫外线对细菌的作用  

紫外线在波长2000-3000A⁰，具有杀菌能力，但穿透性不强，可被普通玻璃及纸片所 吸收。故紫外线常用于手术室、无菌室的空气消毒。 

(一)材料：

大肠埃希氏菌肉汤培养物；  

琼脂平板一个；

灭菌的三角纸片、镊子。

(二)方法：

1、用接种环沾取大肠埃希氏菌菌液两环，放于普通平板上，用扩散棒来回涂布于整个 平板表面。

2、将镊子通过火焰灭菌，夹取无菌的三角形黑纸片一张，置于涂菌平板上一侧的1／3处，用平皿玻璃盖盖上末放纸片的另1／3处，于紫外线下直接照射30分钟(如图4—1)。

3、照射完毕，用火焰灭菌镊子取出纸片，放入消毒缸内，盖好平板，置37℃温箱孵育 18—24小时，观察结果。

图6 紫外线对细菌作用示意图

 三、高压蒸汽灭菌(介绍)

  手提式高压蒸汽灭菌器使用法：

(—)结构与灭菌原理：

手提式高压蒸汽灭菌器是一双层筒状金属容器(见图4-2，图4-3)，两层之间盛水，外层坚厚，上端有盖，盖旁附有螺栓，使用时将螺旋扭紧使盖紧闭蒸汽不能外溢，盖上装有排气阀门，安全阀门，以调节器内蒸汽压力。温度计、压力表以表示内部温度和压力。器内装有带孔的金属搁板，以盛放欲灭菌的物品。高压蒸汽灭菌方法的原理是水在大气中100℃左右沸腾，大气压力增加沸腾温度将随之增加。因此，在密闭的高压灭菌器内，当压力指示蒸汽压力增加到每平方英时15磅(１.05kｇ／cm²)时，温度则相当121.3℃，在这种温度下15—30分钟即可杀死细菌的繁殖体与芽胞。

图7  手提式高压蒸汽灭菌器 图8  直立式高压蒸汽灭菌器

(二)使用方法：  

先将高压蒸汽灭菌器底层加水，将欲灭菌物品放置在金属圆筒搁板内，然后将盖紧闭，扭紧螺旋、器底加热；待器内压力升至5磅时，稍放开排汽阀门约３分种，待压力下降至0时，使器内原来冷空气完全排出，否则压力表所示压力并非全部是蒸汽压力，灭菌将不完全。待空气全部排出后，关闭排气阀门，继续加热，待压力升至所需磅数(一般为15磅)，调节热源，使维持15－30分钟；灭菌时间到达后，便停止加热，待压力自行下降至0时，开 盖取物。切勿突然打开排气阀门放气减压，以免液体的物品冲出容器而外溢。　　　　　　　

四、干热灭菌法(简介)

  (一)应用：

玻璃器血等在灭菌前经洗净，充分干燥，并经适当包装后，放于烤箱内灭菌。

  (二)用法：

将物品放人后，闭门加热(通电)，温度渐升至160—170℃，保持2小时，即达灭菌目的。 

  (三)注意事项：

1、温度不可超过180℃，否则棉塞及包装纸会被烧焦。

2、灭菌之玻璃器皿事先应充分干燥，否则易破裂。 

3、灭菌后，待箱内温度下降至40℃以下时，方可开门。不然，高温时突然开门，骤然  过冷，可能使玻璃发生破裂等意外。

五、滤器除菌(介绍)

经过高压蒸汽灭菌后会变质的物质如血清、胰蛋白酶、氨基酸及维生素等，可采用此法除菌。除菌滤器种类很多，现以蔡氏(Seitz)EK石棉板滤器为例，了解滤器的使用方法。

这种滤器由金属漏斗和夹在其中的石棉滤板组成。EK型石棉板(Enkkeimung缩写, 意为无菌)细菌不能通过(见图9)。

图9 细菌滤器

  把石棉滤板装入漏斗，用牛皮纸包扎后以高压蒸汽灭菌。在使用滤器时打开包纸，取出滤器装在经灭菌的抽滤瓶上。用橡皮管将滤瓶连接装有氯化钙的干燥瓶上，干燥瓶另一端 开口处用橡皮管与抽气泵连接。然后把待滤的悬液注人漏斗内，开动抽气泵进行过滤。滤液多时，须边滤边加，直到滤完为止。

用过的滤器须用高压蒸汽灭菌，然后弃去石棉滤板，洗净金属滤器、拭干，装上新的石棉滤板，用牛皮纸包好灭菌以备下次应用。

目前国内使用的除菌滤器，主要包括Seitz氏滤器和玻璃滤器，用作血清或较浓蛋白 质滤过除菌，应使用加压式Seitz氏滤器。这样可使过滤时不会因产生泡沫等而顺利滤 过。玻璃滤器(见图4—4)为抽滤式，滤板是陶质。用于除菌的规格为C₆较可靠，但不适合血清除菌用。

化学因素对细菌的影响

许多化学物品能使细菌蛋白变性，妨碍代谢中某些重要酶的活力或破坏细胞膜等，导致细菌生长繁殖停顿、甚至死亡。

  影响化学消毒剂杀灭细菌的因素很多，与消毒剂的种类、性质、浓度，细菌种类、数量、 有无芽胞，以及两者接触时间长短、温度高低，环境中是否有有机物存在等都有关。

 一、常用的化学消毒剂对细菌的影响

(—)材料：

白色葡萄球菌液(6亿／m1)，无菌吸管；

肉汤培养基2ml／支；

2％来苏，1：1000新洁而灭及生理盐水。

(二)方法：

用无菌吸管吸0.1毫升白色葡萄球菌液加入下列各管中：生理盐水(2m1)、2％来苏 (2m1)、1：1000新洁而灭(2ml)。 

摇匀、静置一旁，经1、5和20分钟后从各管取出二接种环分别移种于肉汤培养基。

 二、染料对细菌的影响  

很多染料具有抑菌的作用，在一般情况下，细菌都带阴电，故常用碱性染料作为抑菌剂；又因革兰氏阳性菌的等电点比革兰氏阴性菌低，因此，同一种碱性染料，对革兰氏阳性菌的抑菌作用要比革兰氏阴性菌大。

(一)材料： 

白色葡萄球菌及大肠埃希氏菌；

龙胆紫琼脂斜面(含1：100，000的龙胆紫)。

(二)方法：

用灭菌接种环取大肠埃希氏菌及白色葡萄球菌接种于龙胆紫琼脂斜面上。置37℃温箱24小时后观察结果。

生物因素对细菌的影响

在自然界中，除理化因素对微生物的作用外，生物因素即微生物与微生物之间，微生 物与动植物之间也存在各种互相作用的关系。  

一、抗生素的抗菌作用

有的放线菌、真菌和细菌能合成抗生素。抗生素具有抑制和杀死其他微生物的作用， 因而常用来防治各种细菌性传染病。各种致病菌对抗生素的敏感性不同，即使同—种细 菌的不同菌株对不同抗生素的敏感性也有差别。在治疗中，细菌对药物的敏感性也常会 发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生耐药性变异。因此，测定细菌对药物的敏感常用 的方法有纸片弥散法和试管稀释法(本实验为纸片弥散法)。  

(一)材料：

普通平板；

大肠埃希氏菌液(6小时肉汤培养物)；

葡萄球菌液(6小时肉汤培养物)；

干燥药物滤纸片(直径6毫米)、小镊子。

每枚纸片的药物含量为：

青霉素    1单位

链霉素    10微克

庆大霉素 10微克

图10  药物敏感实验

（纸片弥散法)

(二)方法：

无菌接种环取葡萄球菌液2—3环，放于普通平板上，再用无菌扩散棒将菌液均匀涂布于整个平板表面。 

待平板上菌液稍干后，用灭菌镊子取干燥的药物滤纸片(按图6-1)所示位置放于平板上，并在平板背面玻璃上注明药物名称。

  同上方法取大肠埃希氏菌液另做一 份。将平板放37℃温箱24小时后观察结果。

(三)结果：如细菌对药物敏感，则含该药物的滤纸周围无细菌生长，无菌生长的地方称   抑菌环。如细菌对该药物不敏感，则无抑菌环或抑菌环直径较小。细菌对药物敏感度之大小，常以抑菌环直径之大小表示(量度抑菌环的直径时，应包括在滤纸片的直径在内)。一般的结果判定可参考下表。

注意事项：

取细菌涂布平板时，要注意取用6小时培养的幼龄菌。

附录：干燥药物小圆片的制备

将直径为6毫米的小圆滤纸片于15磅高压蒸汽灭菌20分钟后烘干，然后将小纸片分装于灭菌小瓶内，每瓶100片，备用。

以无菌蒸馏水将各药稀释成以下浓度：青霉素：100单位／毫升，链霉素、庆大霉素： 1000微克／毫升。  

取各稀释药液1毫升分别加入盛有100片圆滤纸片的小瓶内，使浸泡1—2小时，然后将浸药纸片真空干燥，此种干燥药纸片保存于4℃冰箱，药效可维持l—2个月。

二、细菌素对细菌的影响(介绍)

细菌素是某些细菌产生的一类抗菌物质，但作用范围狭窄，有一定特异性，只对产生细菌素菌株有近缘关系的细菌有作用。

大肠菌素是细菌素的一种，其基因位于细菌质粒上，称Col因子。某些大肠埃希氏菌产生的大肠菌素(Colisin)能抑制另—种大肠埃希氏菌的生长。

(一)材料：

带有ColE2的大肠埃希氏菌菌株；

敏感菌：大肠埃希氏菌K—12，W1485株；

普通平板、肉汤、0.7％半固体琼脂；

吸管、氯仿。

(二)方法：

1、把产生大肠菌素的大肠埃希氏菌菌株点种于普通琼脂平板上，37℃培养过夜。 

2、用氯仿熏上述平板一小时，以杀死点种的大肠埃希氏菌。

3、把敏感菌株接种于肉汤管，37℃孵育12小时，经5倍稀释后，吸0.1ml加于3ml 0.7％半固体琼脂(约50℃)中，迅速混匀倾注在上述平板上层，待凝固后孵育过夜，观察结果。

三、噬菌体特异性溶菌现象    

(一)材料：

大肠埃希氏菌、葡萄球菌18—24小时肉汤培养物；

大肠埃希氏菌噬菌体；

普通平板。

(二)方法：

1、于普通琼脂平板底，用蜡笔划两个直径约2厘米的圆圈。

2、 用无菌接种环取大肠埃希氏菌及葡萄球菌液分别涂布于圈内，并作好标记。

3、待接种的菌液干后，再用灭菌的接种环取大肠埃希氏菌噬菌体分别点种于涂布有细菌的圆圈中心上。

4、将平板放37℃孵育24小时，观察是否有蚀斑出现并记录结果。

四、噬菌体效价测定法介绍(试管法)  

(一)材料：    

大肠埃希氏菌6小时肉汤培养物、大肠埃希氏菌噬菌体、肉汤培养基、小试管、吸管。

(二)方法：

1、取无菌小试管10支，排列于试管架上并编号。

  2、每管加肉汤0.9毫升；

3、 加大肠埃希氏菌噬菌体各0.1毫升于第1及第10管，第一管用吸管吸放3次均匀  后，取出0.1毫升至第2管，同法混合后，取0.1毫升至第3管，如此作10倍稀释，直至第  8管止。最后混匀后，自第8管吸出0.1毫升弃去，第9管不加噬菌体。

4、加大肠埃希氏菌菌液于第1至第9管，每管0.1毫升，第10管不加菌液，摇匀，37℃孵育4—8小时左右。发现只有细菌的对照管出现混浊时，观察结果，凡能发生溶菌的噬  菌体最高稀释度即其效价。

细菌的致病作用

细菌的致病力包括侵袭力和毒素。前者是指细菌的一些酶类及其它表面结构物质。  细菌所产生的侵袭性酶有透明质酸酶、链激酶、血浆凝固酶等。毒素有内、外毒素两种。通过本实验了解透明质酸酶和外毒素、内毒素的致病作用。 

一、透明质酸酶(又称扩散因子)试验

(—)材料：

家兔；

乙型溶血性链球菌24小时肉汤培养滤液；

黑墨水、生理盐水及无菌注射器及针头等。

(二)方法：

1、取家兔—只，将背部两侧毛剪去(或用脱毛剂将毛脱去)。

2、分别取乙型溶血性链球菌24小时肉汤培养物滤液0.5以及盐水0.5m1，各与等量 黑墨水混合。

3、于家兔．背部一侧皮内注射乙型溶血性链球菌滤液与黑墨水混合液0.1ml，于另一侧皮内注射盐水与黑墨水混合液0.1m1，作为对照(注射时注意避免漏出；以免使表皮着色，影响结果的观察)。 

4、注射后1小时观察结果，比较两侧黑墨水扩散范围的大小并记录之。

二、破伤风外毒素的毒性作用    

   (一)材料：

小白鼠；  

破伤风杆菌培养物滤液(内含破伤风外毒素)。

(二)方法：

1、取小白鼠一只,于后腿肌肉注入破伤风杆菌培养物滤液0.1ml。

2、次日观察结果，可见肌注侧的下肢及尾巴首先强直，并逐渐延及另一侧下肢及全身，1—2日后死亡。

注意事项：

1、注射破伤风外毒素时，需提高警惕，小心操作以免发生意外。 

2、注意外毒素用过的针头、注射器及沾有外毒素的棉签，应放人指定容器内，切勿到处乱放。

三、内毒素的致热作用

(一)材料：

加热杀死的伤寒沙门氏菌培养液；

肛探体温计、无菌注射针头、酒精、棉球、凡士林。

(二)方法：

1、先用体温计测试家兔体温，测试方法如下：

1)用酒精棉球消毒体温计，抹上少量凡土林。

(2)将家兔轻轻抱起放于实验台上，将其头部用手臂夹牢于肘间，用—手提起尾巴，另一手从肛门将体温计插入。插人时动作要轻，避免动物挣扎而影响体温。

(3)经3分钟后取出体温计，用干棉球擦去凡士林，观察并记录体温。

2、用注射器吸取伤寒杆菌液0.5—1毫升注入家兔耳静脉内。

3、注射后经30分钟与60分钟，再分别测试体温，观察是否较前升高。

注意事项：

1、测量家免体温时动作要轻柔，以免家兔挣扎而影响体温。

2、体温计插人家兔肛门时宜先稍向下插入后，再徐徐向上插入。 

动物实验技术

实验动物常用作病原微生物的分离，毒力测定，致病作用的研究及免疫血清的制备。在进行微生物动物实验时应选择易感性高、易于喂养、易于获得和最好能在实验室内大量繁殖的小动物。所用的动物必须身体健康，若自外购买者应隔离一定时间观察无病才可应用，尽可能使用纯种，按不同的实验要求选取不同的动物、一定的体重与年龄。常用的实验动物为小白鼠、豚鼠、家兔、大白鼠、猴等；大动物则有羊与马等。

本实验的目的是练习常用实验动物各种接种途径的操作法。 

一、小自鼠皮下注射法

(一)材料：

小白鼠；

无菌注射器(2m1 )及注射针头(5号或5.5号)；

碘酒、酒精、无菌生理盐水。

(二)接种法：

l、用注射器吸取生理盐水0.5mL。  

2、使小白鼠爬行于桌上，右手牵其尾，则鼠向前急窜，用左手食指及拇指捉其两耳及颈部皮肤，将手反转使小白鼠腹部向上，把小白鼠之尾及其右后腿夹于左手小指及手掌之  间(见图11—1)，然后用碘酒及酒精消毒小白鼠腹部皮肤。  

3、注射时，要使局部皮肤绷紧。然后注入0.3ml生理盐水。

二、白鼠腹腔接种法

(一)材料：

与小白鼠皮下接种法相同

(二)接种法：

图11—1  小白鼠腹腔接种法

 1、用注射器吸取生理盐水lml。

 2、捕捉小白鼠使其腹部向上(方法同上)，然后用碘酒和酒精消毒小白鼠腹部皮肤。

 3、注射生理盐水0.5ml于腹腔内(先稍平刺人皮下，然后斜刺人腹腔)(见图12)。

&nbwww.med126.comsp;

三、小白鼠肌肉注射法

(一)材料：

与小白鼠皮下注别法相同。

(二)接种法：

1、用注射器吸取生理盐水0.5ml。

2、捉小白鼠使其腹部向上(方法同上)，用碘酒、酒精消毒小白鼠左后腿皮肤。

3、注射生理盐水0.2ml于左后腿肌肉。

 四、家兔静脉注射法  

(一)材料：

家兔；

无菌注射器(1ml)及注射针头5.5或6号；

碘酒、75％酒精、无菌生理盐水、棉花拭子：

(二)方法：

1、家兔置于台上，固定之。

2、用碘酒消毒耳缘静脉，然后用75％酒精洗去碘酒并揉擦耳缘静脉，可使静脉扩张。

3、用注射器吸取生理盐水0.5ml(如有气泡应驱尽)，将针头刺人静脉内轻轻抽吸，见有血回流即注入0.5ml生理盐水(注入后局部应无隆起)(见图11—2)。

4、注射后，用棉花拭子压出血处，至血凝固为止(如注射多次，应以离耳根远处静脉开始注射，以免静脉阻塞，影响以后注射)。  

图11-2．  家兔耳静脉注射法

五、小白鼠脑内接种法

(一)材料同一。

(二)接种法：

   1、用注射器吸取生理盐水0.3ml(不可超过0.05m1)，用4号针头。

2、捉小白鼠使其俯卧在桌面上，用碘酒、酒精消毒其眼耳之间皮肤，然后于消毒处将 注射器垂直刺人3mm，注人生理盐水(见图11—3)。

六、小白鼠的解剖检查法

(一)一般解剖检查：  

1、解剖器械(剪刀、镊子等)煮沸消毒。

2、将小白鼠置于解剖板上，腹部向上，

伸展四肢，用图钉钉住四肢。

3、用碘酒及酒精消毒胸部和腹部皮

4、耻骨上缘至胸骨上端之间沿正中线作皮肤剪开，在剪开之上下两端再向四肢剪开，剥离皮下组织，使皮肤向外翻转。图11—3

5、检查皮下组织，腹股沟及腋下淋巴腺。如有腹水，可用注射器或毛细管刺人 小白鼠脑内注射法

腹腔抽出液体，供培养或涂片检查。

6、从耻骨联合到横膈膜剪开腹腔，由切口上下端横剪使左右腹膜向外翻转；暴露腹腔  内脏，检查各脏器，取材培养及涂片。

7、剪开胸软骨，将胸骨翻起，检查胸部内脏，并取材作培养及涂片(如主要病变在胸腔，则可先开胸腔，后开腹腔)。 

8、解剖完毕，将动物先放消毒桶内，然后焚化或掩埋，解剖器械可用煮沸消毒。

(二)取脑组织法： 

1、将被剖检小白鼠自腋下剪开腋下动脉放血致死(目的是减少脑组织的含血量)。然后浸人2％来苏溶液中片刻，使毛湿透，以免体表寄生虫及细菌在解剖时污染脑组织。

2、固定：使背部朝上，头部涂以碘酒消毒，沿头部中线剪开皮毛并拨向两侧，使头骨暴露。

3、以碘酒消毒头骨。

4、更换小的剪、镊，沿头部周围剪开头骨，并剥离之。

5、用弓形小剪把脑组织自脑底部整个挑起，放人无菌平皿内备用。

实验四  病毒的形态和病毒感染的检查

病毒的形态

一、病毒的电子显微镜图的观察

病毒颗粒很小，常以毫微米(nm)作为测量大小的单位，但外观上仍具有球形、杆状、砖形和蝌蚪形几种基本形态。利用电子显微镜观察病毒颗粒的负染色标本或含有病毒的细胞和组织制备的超薄切片标本，可以更精细地观察各种病毒颗粒的形态和结构。

(一)腺病毒；

   (二)乳头瘤病毒；

(三)单纯疱疹病毒；

  （四)EB病毒；

  （五)痘病毒；

  （六)流感病毒；

(七)轮状病毒；

(八)甲型肝炎病毒；

二、病毒包涵体的观察

某些病毒感染后，在宿主细胞内可形成包涵体。一般认为包涵体是病毒合成的场所，

也可能是病毒颗粒结晶的聚集，或是感染细胞晚期的退化性变化。根据包涵体形成的部位可分为胞浆内或核内包涵体；如按染色反应则可分为嗜酸性和嗜硷性包涵体。一种病毒所产生的包涵体是有一定的形态和部位的，因此包涵体的梭查，对诊断某些病毒性疾病有一走的辅助价值。  

  （一)狂犬病病毒包涵体的观察：  

狂犬病毒是弹状病毒届的一种，可致野生动物及多家畜感染，亦可引起人类狂犬病。  该病毒为RNA型病毒，有血凝特性。病毒在易感动物及人的中枢神经细雄中增殖，形成

胞浆内、嗜酸性、圆或椭圆形包涵体，称内基(Negri)氏体。  

一般镜下所见是大脑海马回组织切片，经HE染色，内基氏体于胞浆内呈圆或椭圆形

红色斑块。

(二)呼吸道合胞病毒包涵体的观祭：

呼吸道合胞病毒是RNA型的呼吸道常见感染的一种病毒。有包膜而无血凝素结构，能在人和猴的多种细胞中生长繁殖，感染细胞形成融合的多核巨细胞，并产生胞浆内圆形的嗜酸性包涵性，一般镜下所见为人胚肾细胞的感染标本。

(三)腺病毒包涵体：

腺病毒为RNA型呼吸道感染、结膜及淋巴结感染的常见病毒。具有血凝特性，能在人胚多种细胞、猴肾细胞及肿瘤传代细胞中生长繁殖，在感染细胞核内可形成不规则形状的嗜硷性包涵体。

通常镜下观察Ⅲ型腺病毒感染HeLa(子宫颈瘤)细胞所出现的核内嗜硷性包涵体。

病毒的培养

一、病毒鸡胚培养法

鸡胚培养方法操作简便，适用于流感病毒、痘病毒、疱疹病毒和脑炎病毒等的培养。

鸡胚培养的接种方法有多种，最常用的有：绒毛尿囊膜接种法、羊膜腔接种法、尿囊腔接种法和卵黄囊接种法。可根据病毒的特性，选择适宜的接种途径。  

(一)受精卵的检查：

(1)受精卵的选择，一般健康鸡所产，可在产后10天内应用。

(2)37℃—38℃，相对温度45—60％为鸡胚发育最适环境，每天翻动两次(接种病毒后

温度应为35—37℃)。

(3)孵育后第4天检卵：

活鸡胚一可见清晰的血管，有胚动。

死鸡胚一鸡胚不动，血管昏暗模糊。

未受精卵一不见鸡胚痕迹。

{4)接种前定胚位，在捡卵灯下画出气室、胚胎位置及打孔部位。

   (二)观察鸡胚模型图：

观察鸡胚胎膜型，注意绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔及卵黄囊位置，以上均是病毒接种

的常用部位{见图12—1}

(三)鸡胚卵黄囊接种法：

材料：

鸡胚(已孵育6—8天)；

无菌注射器、碘酒、酒精，、锥子。

方法：

(1)取孵育6—8天的鸡胚，将气室及胚位划出。 

(2)将卵置卵架上，气室向上。用碘酒、酒精消毒气室部的卵壳。 

(3)用无菌锥子在气室部在卵壳中心钻一小孔，注射器由气室小孔向胚胎位置相反方

 向、沿卵中轴作20—30度角倾斜刺人约3厘米，即达卵黄囊内，注入被检材料0．5毫升（见图27—1)。

(4)拔出针头，用熔化石蜡封上穿刺孔。

   (四)鸡胚绒毛尿囊膜接种法：

材料：

鸡胚(已孵育12天)；

牛痘病毒稀释液；

生理盐水；

lml无菌注射器、6号针头、锯片、解剖刀、毛细吸管、橡皮吸头、锥子、小镊子、剪刀。

方法：

 (1)取已孵育12天之鸡胚，将气室及胚位划出；，并在胚胎附近找一血管较少的部位划一个三角形。

(2)碘酒消毒后，以磨牙机或锯片沿三角形磨破卵壳但不伤及卵膜，并在气室部的卵壳正中钻一孔。

(3)将卵平置架上，用解剖刀轻轻将三角形部位的卵壳揭去，形成卵窗露出卵膜(见图－12)。

(4)于卵膜当中以利针刺破一小缝，以橡皮吸头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷与卵膜分离，而成“人工气室”。

   (5)将卵膜去掉，即滴人接种材料0.2ml(本次实验接种牛痘病毒稀释液)。

(6)迅速将胶布封于三角形卵窗上，以溶化石蜡封闭气孔。

(7)接种后将鸡胚水平放置于37℃孵育48-72小时。

(8)解剖及收获：将待收获鸡胚卵窗周围用碘酒消毒，用无菌镊子扩大卵窗，除去壳膜，轻轻夹起绒毛尿囊膜，用小剪沿人工气室周围将接种的绒毛尿囊膜全部剪下。天花、牛痘、单纯疱疹等病毒在绒毛尿囊膜上，可形成特殊的疱样改变。

(五)鸡胚尿囊腔接种及尿液收取方法：

材料：

9—11天鸡胚；

流感病毒；

无菌1ml注射器附6号针头；

灭菌中试验；

毛细管、橡皮吸头、小锥子、小镊子。

方法： 

(1)取已孵育9-11天之鸡胚，置检卵灯上检视，将气室及胚胎位置划出，在尿囊与气交界边缘上0.5—lcm处作一标记。

(2)以碘酒消毒该标记部位。

(3)以消毒钻子钻孔，仅破卵壳勿穿破壳膜(见图-12)。

(4)将鸡胚直立：注射器垂直经气室而穿人约lcm即达尿囊腔，注射量为0.2ml。

(5)接种后，以熔化石蜡封此小孔，在卵壳上标记接种病毒名称，接种日期。放37℃培养，如接种流感病毒，一般于接种后孵育37'C40—48小时即可收获。

(6)解剖及收获：收获前应先将鸡胚放4"C冰箱过夜，使其血液凝固，避免收获时出血。将鸡胚直立卵架上，消毒气室部位蛋壳，用无菌镊子将壳除去，另用一无菌镊子撕开壳膜及绒毛尿囊膜。用无菌毛吸管吸取尿囊液(约可得5—6m1)。流行性感冒、腮腺炎、新城鸡瘟等病毒都可应用鸡胚尿囊腔接种进行繁殖，并可通过病毒血凝试验加以证明。

(六)鸡胚羊水囊接种法：

材料：鸡胚(已孵育10—12天)；

无菌注射器、碘酒、酒精、镊子。

方法：

(1)取孵育10—12天的鸡胚，将气室及胎位划出。

(2)将卵竖置卵架上，消毒气室部卵壳。

(3)用磨卵器在气室部的卵壳上钻一圆形裂痕，直径约2cm，细心地用镊子除去蛋壳及壳膜，但勿破坏绒毛尿囊膜。

(4)用无菌的钝尖小镊子穿过绒毛尿囊膜，轻轻将羊膜夹住并呈伞状提起，然后用注射针刺入羊膜腔内，注入量这0.05—0.1ml(见图-12)。

(5)用无菌玻璃纸复盖气室打孔处，再用石蜡封闭四周。

图12 鸡  胚  接  种

二、病毒的细胞培养（录像)

   (一)原代细胞单层培养：

   原代细胞单层培养法，是指动物(包括脊椎动物和无脊椎动物)的组织自机体取出后，经胰酶或其他细胞分散剂消化处理，得到单个细胞悬液，以一定量接种到特定容器中，加入细胞生长所必需的营养液，置合适温度中经一段时间的培养，分散的单个细胞即贴附玻壁，开始分裂增殖并逐步长成均匀致密的单层细胞。组织来源种类很多，如猴肾、地鼠肾、鸡胚、人胚肾及蚊子等，本实验仅通过鸡胚单层细胞培养，了解病毒组织培养的技术方法。

材料：

鸡胚(已孵育9—10天)；

无菌小剪与镊子；

无菌玻皿用具(包括培养板或培养管、平皿、中试管、漏斗附四层纱布、三角瓶附磁棒、

胶塞、吸管、毛细吸管等)；

血球计算盘、电磁搅拌器、Hanks液(配法见附录)；0.5％水解乳蛋白Hank’s液、小牛血清(56℃，30分钟灭活)，0.25％胰酶、5.6％NaHCO₃抗生素(青霉素1万iu／ml，链霉素1万iu／ml)。

营养液配制：

小牛血清 5ml

0.5％水解乳蛋白Hank’s液   94ml

抗生素原液  lml

用5.6％NaHC0校正pH为7.4—7.6。

方法： ．

1、，解剖及处理鸡胚：

(1)将孵育9天的鸡胚以碘酒消毒气室部位的卵壳后，用无菌小弯镊子钩取鸡胚置平皿内，用小镊子除去鸡胚头、爪及内脏，取其皮肤及骨骼组织，用Hank’s液洗二次，除去残存血液(洗涤用的Hank’s液需加双抗，以下同)。

(2)用无菌剪子将鸡胚剪碎成0.5—1mm³小块，加入Hlank’s液3—5ml，转人中试管内。 

(3)静置5分钟，让组织块自然沉降，用毛细吸管吸除上清，再加入Hank’s液，重复处理一次。

2、胰蛋白酶消化： 

(1)按每鸡胚5ml用量算，加入0.25％胰酶液，置37℃水浴箱中消化半小时。

(2)吸除胰酶液，再按上法用Hank’s液洗涤组织块二次，以除去剩余的胰蛋白酶溶液。

3、分散细胞：

  加入5ml培养液，并将组织块移人附有磁棒的小三角瓶中，置电磁搅拌器上搅拌10分钟，使鸡胚组织块的细胞尽量分散，然后用四层纱布过滤，获得分散的鸡胚组织细胞悬液。

4、细胞计数： 

  吸出少许细胞悬液，滴入血球计算盘内，计细胞数。

5、细胞分装及培养：

  按计算所得的细胞数，用营养液将细胞稀释成100万细胞／ml，接种40孔聚苯乙烯量培养板或细胞培养管，40孔板每孔分装0.1ml(含10万细胞)，加盖盖好，静置平放于CO2培养箱中培养；细胞管每管分装0.7ml(含70万细胞)，用胶塞塞紧，静置斜放使与平面成5⁰角，置37℃温箱中培养24—48小时。培养结束后，置低倍镜下可见生长成单层的鸡胚成纤维细胞，(见图-12)。

(二)病毒接种及病毒对细胞致病作用的观察：

在低倍镜下，选择生长致密成单层的细胞培养管或40孔细胞培养板，吸去营养液；培养管每管加0.1ml(细胞培养板每孔加入0.025m1)的新城鸡瘟病毒液，分别置37℃温箱或CO²培养箱中使病毒吸附30分钟，然后吸除病毒接种物，加入维持液，每管0.7ml或每孔0.2m[(含1％小牛血清的0.5％水解乳蛋白Hank’s液。其他成分同营养液)，置37℃培养。每天取出，在低倍镜下观察有无细胞病变出现(细胞变圆，堆积及脱落)。注意要与不接种病毒的细胞对照作比较。

病毒红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验

某些病毒如粘病毒(流感病毒)、疽病毒(牛痘病毒)、虫媒病毒(乙型脑炎病毒)、肠道病毒(埃可病毒)表面有糖蛋白，在一定条件下，能与动物红细胞表面的糖蛋白受体相结合而形成凝集，此即为病毒红细胞凝集(HA)。利用HA可以检测培养物中某些病毒的存在，滴定病毒的血凝效价，并可粗略估计病毒颗粒的数量(1个血凝单位≈10⁶病毒颗粒)。

若血清中特异性抗体与相应病毒结合后，使病毒失去凝集红细胞的能力而出现抑制血凝现象(HAI)。利用HAI可检测血清中血凝抑制抗体的存在并测出效价。临床上，分别测患者发病早期和恢复期血清抗体效价，对辅助诊断一些病毒感染有一定意义。

一、病毒红细胞凝集试验

（—)材料：

流感病毒鸡胚培养尿囊液； ·

流感病毒血凝素(每0．2ml含4单位)

流感病人早期及恢复期血清；

20孔凹窝塑料板、lml吸管、1％鸡红细胞悬液；

生理盐水、橡皮吸头。

(二)方法：

(1) 取一块洗净晾干的20孔凹窝扭料板，用蜡笔做好标记。用带有橡皮吸头的吸管，于1—9孔内各加入生理盐水0.2ml，在第1孔内加入已经稀释成1：5的流感病毒尿囊液0．2ml，混匀后吸出0．2ml至第2孔，再混匀后吸0.2ml至第3孔，如此稀释到第8孔(病毒稀释度即分别为1：10—1：1280)，自第8孔吸出0．2ml弃去，第9孔不加流感病毒尿囊液作红细胞对照。

(2)每孔加入1％鸡红细胞0.2ml，摇匀置室温45分钟。

(3)观察结果时，直接观察塑料板孔内的红细胞凝集式样(见图29—1)，判断结果并作记录。

最高病毒稀释度呈“++”凝集者作为病毒的红细胞凝集滴度，亦即1个血凝单位。例如： 1：320为“++”，即为1个血凝单位，在红细胞凝集抑制试验中；病毒血凝素需用4个单位，按上例1个血凝单位为1：320，则1：80含病毒的尿囊液即为4个血凝单位。

(三)注意事项：

1、用反复吹吸法稀释混匀病毒或血清时，手法要轻、稳，尽量减少气泡出现。

2、为了实验准确，加红细胞时，应从最后一孔，起向前加。

3、加样毕，可将塑料板放光滑台面上慢慢划圈摇匀，但要防止溅出。

4、观察结果时，塑料板底部垫上白纸，减少移动并按时观察。若延续时间太长，可能会出现病毒凝集红细胞后再离解的现象，因而影响结果。

图13  病毒红细胞凝集示意图

  二、病毒红细胞凝集抑制试验

(1)取干净凹窝塑料板一块，用蜡笔做好标记。用带有橡皮吸头的吸管，于第2至第9孔内加人生理盐水0．2ml。

(2)于第1、第2及第9孔中各加入稀释成1：5的流感病人发病早期血清0．2ml(血清处理见附录)，混匀后，从第2孔吸出0．2ml加入第3孔，按同法稀释至第8孔，吸出0．2ml弃去(血清稀释度分别为1：5-1：640)。

(3)在第1至第8孔中，各加入4单位流感病毒血凝素0．2ml，第9孔不加，作为血清对照。

(4)取同一病人的恢复期血清标本—份，按同法作红细胞凝集抑制试验。

(5)另取两孔，分别作病毒血凝素对照和红细胞对照。第10孔，病毒血凝素对照：盐水0.2ml+4单位流感病毒血凝素0．2ml。第11孔，红细胞对照，盐水0.4ml。

(6)温室静置10分钟后，于l～11孔中各加入1％鸡红细胞0．2ml，摇匀。

病毒红细胞凝集抑制试验可按下表进行：

  (7)室温静置45分钟后观察结果：

  最高血清稀释度能完全抑制红细胞凝集者为红细胞凝集抑制效价。比较早期、恢复期血清的血凝抑制抗体的效价，并作出判断。

  注意事项：

  (1)发病早期、恢复期血清要同时做，以求条件一致。

  (2)其他事项与红细胞凝集试验类同。

病毒中和试验

中和试验是较常用的病毒血清学试验方法。原理是特异性的抗病毒免疫血清（中和抗体)

和病毒结合后，使病毒失去毒力的作用。病毒中和试验通常须在动物、鸡胚或组织培养细胞中进行，常用于流行病学调查或病毒型别鉴定。

一、脊髓灰质炎病毒分型鉴定

本实验用中和试验方法，在组织培养管中进行脊髓灰质炎病毒的型别鉴定。

(一)材料： 

I、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒免疫血清(1：5)：

待鉴定病毒液；

人胚肾单层细胞培养管；

维持液(含2％小牛血清的Eagle液)。

(二)方法： ‘

以三型免疫血清(中和100TCID₅₀病毒的抗体滴度大于I/200)与新分离的病毒组织培养管进行中和试验，以确定新分离病毒是否为脊髓灰质炎病毒及其型别。

1、期待鉴定病毒稀释成1：10，分别与三型特异性免疫血清(1：5稀释)等量混合(0．12,ml+0．12m1)，在37℃水浴中作用12小时。 

2、接种于两支组织培养管中，每管0．1ml，在37℃吸附半小时

3、各管加0．9ml维持液，置36℃孵育，观察7天。

4、试验中应包括血清对照、病毒对照和正常细胞对照，如下所示。

5、病毒加入免疫血清后，不出现病变者表示为该免疫血清所中和。

二、萤光局灶中和试验(FFN)

本试验以检测轮状病毒感染的病人双份血清中特异性中和抗体，结合轮状病毒电泳

及血清型别，以助该病毒的流行病学研究。

(一)材料：

MA104细胞；

轮状病毒四个血清型毒株(Wa，s₂，YO，Hochi)；

牛轮状病毒(NCDV)； 

豚鼠抗轮状病毒血清；

阳性及阴性对照血清；

10％小牛血清的Eagle液；

羊抗豚鼠萤光抗体；

PBS，Tween—20；

96孔细胞培养板。

(二)方法：

1、将MA104细胞接种到96孔细胞培养板上，每孔细胞数为1.5—2.0×10⁴，37℃培养

24小时。接种病毒前用Eagle液洗二次。

2、用20μg/ml浓度的胰酶分别处理4个血清型的轮状病毒毒株，置37℃30分钟，用

Eagle液稀释到200个萤光细胞／50μl。待检血清经56℃30分钟灭活；用Eagle液从1：25

起，作二倍稀释到1：1600。将50μl 各不相同稀释度的血清混合后，至突37℃孵育1小时。  每一血清稀释度加2孔(终浓度：病毒为100个萤光细胞／孔，血清为1：50至1：3200)，·

37℃孵育1小时后，每孔加100μl Eagle液，37℃培养20小时。

3、弃去培养液，加入200μl／孔-20℃无水乙醇，置4℃10分钟固定细胞。弃去无水乙醇，吹干，用PSB—T液(含0.1％Tween—20的PBS)洗板一次。每孔加人100μl用PBS稀

释成1：100的豚鼠抗轮状病毒免疫血清，37℃孵育1.5小时。PBS—T液洗板3次，加入

100μl用PBS稀释成1：100的羊抗豚鼠萤光抗体，37℃孵育1.5小时，用PBS—T液洗板3次，PBS液洗板1次，倒置96孔板在萤光显微镜下观察结果。

(三)结果判断

每块细胞板均设有病毒对照、萤光检测系统对照、阳性和阴性血清对照。从待检血清

二孔平均萤光细胞数比病毒对照平均萤光细胞数减少50％的稀释度倒数，作为中和抗体的滴度单位。

实验五  呼吸道感染的细菌

链球菌

链球菌也是常见的化脓性球菌之一。致病性链球菌可引起猩红热、丹毒产褥热及变态反应性疾病。本实验主要认识链球菌的形态，、菌落特征及其分类。  

认识链球菌溶血素“O”抗体的测定方法及其实用意义。 

(一)观察甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型链球菌的菌落形态及溶血情况。

(二)观察乙型链球菌在血清肉汤中生长情况。

(三)观察镜下链球菌的革兰氏染色形态。

(四)抗链球菌溶血素“O”的测定(胶乳法)。

原理：感染乙型溶血性链球菌后；病者血清中可有链球菌溶血毒素“O”的抗体(Anti—strep-

tolysin O．简称ASO)。人工制备的ASO胶乳试剂(即溶血毒素O的免疫微球)经设法控制其分子数量较一般感染者所产生的ASO少，利用胶乳间接凝集抑制试验原理，使病者血清抗体在加入标准溶血毒素后O后，产生结合后多余的抗体，即可与ASO胶乳试册发生反应，出现清晰均匀的凝集颗粒(ASO胶乳试剂是羧化聚苯乙烯胶乳与溶血毒素“O”的共价交联产物)。

方法：

1、病人血清标本用生理盐水稀释成1：50，以56℃水浴30分钟，灭活补体。

2、于反应板指定位置上，分别滴加已稀释灭活的病人血清、阳性与阴性控制血情各一滴，再在各血清上各加标准溶血毒素O一滴，轻轻摇动约2分钟使之混匀。· ·

3、于上述三个液墒上各加ASO胶乳试剂一滴，轻摇8分钟，观察各位置上有无凝集颗粒以判定结果(见图12—1)。  

 图14  抗链球菌溶血素“O”的测定(胶乳法)示意图

注意：

(1)1：50病人血清阳性反应相当于传统Todd溶血试验ASO≥500单位。若反应很显著，应将病人血清用生理盐水稀释为l：80，甚至1：100。

(2)1：80病人血清阳性反应的ASO≥800单位，而1：100病人血清阳性的ASO≥1000单位。

肺炎球菌

肺炎球菌常寄居于正常人的鼻咽腔中，主要引起大叶性肺炎。本实验主要认识肺炎球菌的生物学特性。

掌握肺炎球菌与甲型溶血性链球菌的鉴别。

(—)观察肺炎球菌在血平板上的菌落形态及溶血特性。

(二)观察镜下肺炎球菌的革兰氏染色形态和荚膜染色形态。

(三)肺炎球菌与甲型溶血性链球菌的鉴别。

肺炎球菌菌落与甲型溶血性链球菌菌落难于区分，须借助于胆汁溶菌试验与菊糖发酵试验方能鉴别。故需做下面几个试验：

1、胆汁溶菌试验：  

分别取在37℃培养18小时的肺炎球菌及甲型溶血性链球菌肉汤培养物各0.8毫升，置于小试管内，再加入无菌胆汁0.2毫升(或10％去氧胆酸钠溶液0.1毫升)。同时以生理盐水0.2毫升与菌液0.8毫升放入另—试管作为对照。摇匀后，置37℃水浴箱中10—15分钟，观察结果。肺炎球菌因其自溶酶被胆汁激活，使菌溶解而变为澄清，甲型溶血性链球菌不被溶解，对照管液体应混浊。

2、菊糖发酵试验

接种菊糖血清肉汤培养基，经37℃18—24小时后，肺炎球菌能发酵菊糖产酸，而甲型溶血性链球菌则否。

3、乙基氢化羟基奎宁(Optochin)敏感试验：

几乎所有肺炎球菌的菌株都对乙基氢化羟基奎宁(C₂H₅O.C₃H₄N.CHOH.C₇H₁N.C₂H₅,  Optochin)敏感，而链球菌通常不被其抑制。将细菌划线接种于含血琼脂平板上，镊取无菌小圆滤纸(直径6毫米)浸于1：4000无菌Optochin水溶液中，放血平板上，37℃孵育18—24小时后取出观察结果。肺炎球菌可于纸片周围呈现直径大于20毫米的抑菌圈，而链球菌无抑菌圈，或偶呈现直径小于15毫米的抑菌圈。

分枝杆菌

分枝杆菌是一类细长杆菌，因繁殖时有分枝生长趋势而得名。本属细菌一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后，即能对抗盐酸酒精的脱色作用，故又称抗酸性杆菌。致病者主要有结核杆菌和麻风杆菌。

本实验主要掌握抗酸性染色法。

认识结核分枝杆菌的形态、培养、动物试验方法。

观察麻风分枝杆菌的形态特点。

   一、结核分枝杆菌形态观察： 

观察镜下结核病人痰标本涂片，结核分枝杆菌抗酸染色的形态特点。

  &nbs医学考研网p;二、结核病人痰液抗酸染色检查法：

材料：

结核病人痰液；

染色液：石炭酸复红，3％盐酸酒精、吕氏美蓝(见附录)；

玻片。

方法：

(—)涂片的制备，取患者清晨咳出的痰液，用棉拭子小心沾取痰液少许涂片。涂片自然干燥后，通过火焰固定，然后进行染色。

(二)染色方法：

1、将涂片平放于染色架上方的支架上(注意平放以免染色液倾泻)，滴加石炭酸复红液(须加稍多量)。  

2、用酒精灯在玻片下加温，至微有蒸气冒出时，移去酒精灯，到蒸汽减少时，再加温，如此持续5分钟(但注意不可将染液煮沸或煮干)，用水清洗。

3、以3％盐酸酒精充分脱色，随即用水冲洗。

4、再用吕氏美蓝染1分钟，用水冲洗，待干，在油镜下检查。

结果：

抗酸菌染成红色，非抗酸菌染成蓝色。

(结核病人痰抗酸染色厚片见附录)。

三、观察结核分枝杆菌菌落：

结核分枝杆菌培养于罗(Lowenstein)氏培养基(见附录)上的菌落呈干燥颗粒状；乳白色或米黄色，形似椰菜花样，注意接种日期。

    四、结核抗体IgG的检测：参阅《免疫学实验指导》实验八：免疫标记技术。 

五、麻风分枝杆菌形态观察：  

直接涂片是麻风分枝杆菌细菌学检查方法之一，自患处刮取标本或自患者鼻部取标本，涂片，作抗酸性染色。

观察镜下麻风分枝杆菌的抗酸性染色形态特征，注意其排列的情况。

实验六、七 肠 道 杆 菌

肠道杆菌是一类革兰氏阴性杆菌，其中一些为非致病菌(包括大肠埃希氏菌、变形杆

菌、产气杆菌等)，另一些为致病菌，主要有沙门氏杆菌(如伤寒沙门氏菌与副伤寒沙门氏

菌)与痢疾志贺氏菌。它们的形态相似，但生化反应及抗原结构颇有差异。因此，常用生化

反应与血清学试验作分类鉴别。

材料：

大肠杆菌、主要沙门氏菌及痢疾志贺氏菌的形态、菌落及生化反应标本，粪便检材。

内容与方法：

 一、大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌

   了解肠道杆菌均为革兰氏阴性杆菌，形态无特殊。  

了解肠道杆菌的生化反应与血清学试验及其在鉴定上的意义。

(一)菌落观察：

观察S．S．琼脂平板培养基(见实验七附录)上的大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌、痢疾

志贺氏菌的菌落特征。

(二)形态观察(参考)：  

观察镜下大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌的革兰氏染色形态，注意形态

染色性有无区别。  

(三)生化反应观察：

观察大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌在双糖铁培养基(见附录)的生化反应，观察变形杆菌的尿素分解反应。

（四)血清学鉴定(方法见粪便标本检查项)。

二、肠道杆菌致病菌的分离鉴定(粪便标本的检查)：

粪便中存在的细菌很多，常见的病原菌有沙门氏菌属、志贺氏菌属的细菌、致病性大

肠埃希氏菌、霍乱弧菌和结核分枝杆菌等。除检查霍乱弧菌外，一般不做直接涂片检查。同时检材必须注明检查目的，以便选择检查方法。下面以自粪便标本分离沙门氏菌属和志贺氏菌属的细菌为例。

这些肠道细菌都是革兰氏阴性杆菌，它们之间的鉴别，主要依靠生化反应检查和血清

学鉴定的方法。通常取粪便作致病性肠道杆菌鉴定的步骤是：选择培养基分离细菌→生化反应鉴定→血清学抗原鉴定。

(一)标本采集：

用无菌棉拭子取患者粪便少许(疑为痢疾病人时，应挑以粘液脓血部分)，标本应尽快

分离培养，如不能立即接种，应放冰箱或存放于缓冲甘油盐水保存液中。

（二)检查程序：

(三)沙门氏菌属的鉴定与分型：

1、生化反应：  

沙门氏菌属中，除伤寒沙门氏菌在发酵中不产气外，通常在分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇及山梨醇中均产酸产气；不分解乳糖、蔗糖及水杨素；不产生靛基质、不液化明胶；硫化氢反应通常为阳性。

2、血清学分型鉴定：

（1)取纯菌培养物，先与A—E群沙门氏菌多价⊕血清做玻片凝集试验，阳性者认为该菌属于沙门氏菌属。

（2)用沙门氏菌属各群特有的单价⊕因子血清，做玻片凝集反应，可最后判定为何种菌。

（4)新分离的伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌株，常只与Vi血清凝集，而不和⊕血清凝集。如将培养物加热100℃30分钟（破坏Vi抗原)即可与多价⊕血清和⊕因子血清凝集。  

(5)与A-E群多价⊕血清凝集，而与各个⊕因子血清却不凝集的菌株，有时可能属于副大肠杆菌(如亚利桑那或枸椽酸盐菌)。这部分菌株与沙门氏菌有密切联系，不仅某些生化反应极为相似，而且带有与沙门氏菌相同的O与H抗原。

(四)志贺氏菌的鉴定与分型：

1、生化反应： ． ·

痢疾志贺氏菌均能发酵葡萄糖；A群不发酵甘露醇，B、C、D群大部分发酵；宋内氏能迟缓发酵乳糖，其余均不能使乳糖发酵；除少新城型、孟城型在发酵糖类时产生微量气体

外，其余不产气；不发酵水杨素和侧金盏醇；于枸椽酸盐培养基上不生长；V-P(Voges—Pmskauer)试验阴性；不分解尿素和液化明胶；不产生硫化氢。

  主要沙门氏菌抗原结构表

志贺氏菌属生化反应表

  2、血清学分型鉴定：

  志贺氏菌一般只含O抗原，根据O抗原不同，可分为四个群，有的群还可以分为若干血清型及亚群。

A群：包括10个血清型，均为甘露醇发酵阴性，其中1型即志贺氏痢疾杆菌，2型即史密斯氏志贺菌。其余各型十分罕见。

B群：即福氏志贺菌，包括甘露酵发酵阴性，已有13个血清型(包括亚型和变种)。

C群：即鲍氏志贺菌，此群共15个菌型(一般能分解甘露醇)。

D群：即宋内氏志贺菌，只有一个血清型，分解甘露醇，但其菌落常可出现两种不同形 态变种：S型和R型。

经初步检查符合志贺氏菌属生化特征的菌株，均需用诊断血清及因子血清分型。在进行玻片凝集试验时可参照生化反应，具体做法如下：

①甘露醇不发酵，靛基质阴性者，用志贺氏1型(原志贺氏)诊断血清；

②甘露醇不发酵，靛基质阴性者，用志贺氏2型诊断血清；

③甘露醇发酵、乳糖不发酵者，用福氏及宋内氏诊断血清；

④甘露醇发酵，乳糖迟发酵者，用宋内氏诊断血清；

⑤甘露醇发酵，福氏及宋内氏血清不凝集者，再用鲍氏诊断血清。

⑥仍不凝集者，应考虑K抗原存在，要将菌材料传代或煮沸，再用福氏、宋内氏及鲍

氏血清做凝集反应。福氏诊断血清最后鉴定菌型要用因子(单型)血清。

三、肥达氏试验(Widal test)    

人患伤寒后。经过一定的时间，血清内出现特异性抗体，此种抗体与伤寒沙门氏菌结合时，能使细菌发生凝集，肥达氏试验即利用此原理来作为伤寒病或副伤寒病的辅助诊断。

材料：可疑伤寒病人血清(稀释成1：10)； ．：

伤寒沙门氏菌“O”抗原、伤寒沙门氏菌“H’’抗原； ：

甲型副伤寒沙门氏菌“H”抗原(A)、乙型副伤寒沙门氏菌“H”抗原(B)

生理盐水、小试管、1毫升吸管。 

方法：  

(一)取洁净小试管28支，排列在试管架上，分为4排，每排7支，依次用蜡笔注明管

号，用吸管吸取生理盐水分装于小试管中，每支0．5毫升。

(二)用1毫升吸管吸取1：10的病人血清0．5毫升，加入第l排第1管内，于管内连续

吹吸3次，使血清与盐水充分混合，然后吸出0.5毫升放人第2管，同样吹吸混匀后，吸出

0．5毫升放人第3管，如此继续稀释到第6管，自第6管吸出0．5毫升弃去。此时第1管

到第6管的血清稀释倍数为1：20-1：640。第7管不加血清作为对照。

(三)同法于2、3、4排试管中将人血清依次稀释。

(四)血清稀释完毕后，于第1排加入伤寒沙门氏菌“H”抗原，每管0．5毫升；第2排加入伤寒沙门氏菌“O”抗原；第3排加入甲型副伤寒沙门氏菌“H”抗原(A)；第4排加入乙型副伤寒沙门氏菌“H”抗原(B)，每管均为0.5毫升。

    (五)轻轻振荡试管架,使各管内容物混匀，放37℃温箱中过夜，次日取出观察结果。凡与抗原能产生‘‘++”凝集的最高血清稀释度，即为该血清的凝集效价。

(六)观察结果注意点与免疫学实验中的试管凝集反应同 

实验八  创伤感染的细菌

 葡萄球菌

葡萄球菌是化脓性炎症最常见的病原菌，分布广泛，主要引起疾病者为金黄色葡萄球。

本实验主要认识葡萄球菌的生物学特性，掌握致病性与非致病性葡萄球菌鉴别法。

(一)观察金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌在血平板上的菌落形态，溶血特性及色素。

(二)白斜面菌种取菌涂片作葡萄球菌的革兰氏染色形态观察(因从固体培养基取材涂片，应用生理盐水稀释)。  

(三)病原性葡萄球菌的鉴定：

1、甘露醇发酵试验：观察金黄色和表皮葡萄球菌对甘露醇发酵情况。

2、血浆凝固酶试验(Coagulase Test)：  

(1)试管法——于各含0.3ml兔血浆的二支小试管中，分别加入金黄色和表皮葡萄球菌各二接种环，混匀后放37℃水浴箱中1小时，取出观察结果(游离型血浆凝固酶)。

(2)玻片法——取载玻片一张，用毛细吸管吸兔(或人)血浆，按图示（见图11-1)滴于玻片上，再以接种环无菌法取葡萄球菌分别放人图示液滴中并混匀。于数分钟内观察是否出现凝固小颗粒以判定结果(结合型血浆凝固酶)；实验中应以生理盐水做一份对照。

图11—1 血浆凝固酶试验(玻片法)

厌氧芽胞杆菌

厌氧芽胞杆菌又称梭状芽胞杆菌，均为G⁺杆菌。对人致病者有破伤风杆菌、气性坏疽病原菌和肉毒杆菌。

了解常用的厌氧培养法。

认识破伤风杆菌，产气荚膜杆菌及肉毒杆菌的形态及培养特点。，

观察破伤风杆菌和产气荚膜杆菌的动物试验，以理解两菌的致病特点。

 一、厌氧培养法

(—)庖肉(肉渣)培养法：

1、将破伤风杆菌(或产气荚膜杆菌)菌液分别接种子一管庖肉培养基(Cooked MeatMedum)及一管普通肉汤培养基中。

2、放37℃培养48—72小时后观察有无生长，并作涂片染色检查。

注：庖肉培养基肉渣中不饱和脂肪酸的氧化，能消耗溶解于培养液中的氧，且组织中所含的还原性化合物，如谷胱甘肽(含—SH基)，可使培养基的氧化还原电势下降，故造成厌氧环境。

(二)焦性没食子酸法：

材料：

产气荚膜杆菌菌液；

血平扳、无菌玻璃板(12* 12cm)、消毒小方纱布，焦性没食子酸、20％NaOH、毛细吸管、溶化石蜡。

方法：

1、取产气荚膜杆菌菌液；划线接种于—血平板上；然后取无菌玻璃板，中央放一小块纱布，纱布上放0.5克焦性投食子酸；用吸管加入lml20％NaOH，立即将已接种的平板复盖于其上，并迅速用已溶化的石蜡封好平板与玻璃之间的空隙，待封固后置37℃温箱中孵育48小时看结果(见图21—1)。

图15  平板焦性没食子酸厌氧培养法

2、取上述菌液接种于另一平板上，在普通有氧环境下，置37℃孵育48小时，观察有无细菌生长。

(三)厌氧袋法：

1、将接种好的血平板以及产气管、指示剂、催化剂一并放人塑料袋内，并用大铁夹将塑料袋夹紧密封，以防漏气(如图21—2)。  

2、将产气管内的安瓿自尖端弄破，随后即有C0₂和H₂产生(大多数厌氧菌的生长还需要有一定量的C0₂)。

反应式如下：

C₃H₃O₇+NaHCO₃→Na（C₆H₅O₇)+3H₂O+3CO₂

NaBH₄+2H₂0→NaB0₂+4H₂

催化剂(钯)可催化H₂和袋内的O₂生成H₂O，从而耗尽袋内的O₂，由此造成厌氧环境。

3、产气管弄破半小时后将指示剂(美白)安瓿弄破，如美白(无色)不变成美蓝(蓝色)，则指示袋内已成厌氧环境(厌氧环境的另一指标是袋内产生多量的小水珠)。

4、将上述厌氧袋置37℃温箱孵育48小时观察结果。

附注：造成厌氧环境取决于三个因素：①塑料袋密封；②产生足量的H₂；③钯的活性正常。

图16  厌氧培养—厌氧袋法

二、观察镜下破伤风杆菌、肉毒杆菌的革兰氏染色形态及产气荚膜杆菌的荚膜染色形态。

三、观察破伤风杆菌、产气荚膜杆菌在庖肉培养基中的生长特点和在血平板的菌落特点。

四、观察产气荚膜杆菌在牛乳培养基(Milk Medium)中的生长现象：

产气荚膜杆菌，强烈发酵牛奶，使牛乳凝固，析出乳清，凝固的牛乳又被气体穿破呈海棉状，甚至将覆盖层之凡士林推至管口，称之为汹涌发酵。

五、观察产气荚膜杆菌在高层葡萄糖琼脂培养基中生长现象：

六、破伤风毒素抗毒素中和试验：

(—)材料：

破伤风杆菌培养物滤液、破伤风抗毒素、小白鼠及无菌注射器等。

(二)方法：  

1、将破伤风抗毒素0.2毫升(内含抗毒素100—200单位)注射于小白鼠腹腔，经过一小时后，再于小白鼠后腿肌肉注入经适当稀释的破伤风杆菌培养物滤液(内含外毒素)0.1毫升。

2、取另一只未注射抗毒素的小白鼠，将同量的破伤风杆菌培养物滤液注射于后腿肌肉内。  

以上两只小白鼠分别用染料作标记。

3、第二天观察结果，未经注射抗毒素的小白鼠，可见注射外毒素—侧的下肢和尾巴首先强直，并逐渐延及另侧下肢及全身；1—2日后死亡；而预先注射抗毒素的小白鼠则不发病，受到保护。

七、产气荚膜杆菌的动物试验：

取0.5毫升产气荚膜杆菌培养物，自尾静脉注射于小白鼠，10分钟后将其杀死。放37℃温箱中5—8小时，取出可见小鼠尸体气肿现象，尸体剖检可见肌肉有坏死，肝脏呈泥状，并有特殊的臭味。取其肝脏作涂片，染色镜检，可见具有荚膜的产气荚膜杆菌。

实验九  性感染和输血感染的微生物

梅毒螺旋体

   梅毒螺旋体尚不能用人工方法培养分离，临床以直接涂片镜检和血清学试验为主要检测手段。在梅毒血清学试验中，常用的方法：有华氏(Wassermann)反应，康氏(Kahn)反应等一类非密螺旋体抗原试验，是用正常牛心肌类脂质抗原测定病人血清中的反应素；也有梅毒螺旋体制动试验，间接血凝试验和荧光抗体试验第一类密螺旋体抗原试验。

本实验介绍一种改良的梅毒血清学试验-USR。该试验即可定性，又可定量。试剂及对照已标准化，操作简单，有较高的敏感性。但同属于非特异性反应素试验，故应结合临床进行综合判断。

(—)材料：

USR试剂(主要包括以纯化的心磷脂、卵磷脂、胆固醇配制的VDRL抗原)；

反应板；

滴管、专用针头(45滴／毫升±1滴)；

反应标准图(见图17)；

梅毒阳性血清对照。

(二)方法：

玻片定性试验(在23~29℃下进行)

1、  吸取待检血清(不需56℃灭活)0.05毫升加入并扩散在玻片圆圈中。

2、用专用针头滴管，吸取本试剂，于上述血清中垂直滴注抗原1滴。

3、按每分钟约180次用手式机械摇动玻片4分钟，在3分钟内置于100倍显微镜下观察结果。

4、结果判断(按USR试验反应标准)：

阳性反应(3+—4+)：可见中等至大的凝块，溶液清亮。

弱阳性反应(1+—2+)：可见小的颗粒聚集物。

可疑反应(±)：可见细小粗糙物，分布不规则。

．  阴性反应(—)：抗原颗粒均匀分布，无块状物。