实验二十三? 血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定
（综合性实验)
【实验目的】
本实验采用多种实验技术方法以分离、纯化和鉴定血清中的γ-球蛋白，达到训练综合运用及掌握电泳、离心、层析等基本的生物化学实验操作技术的目的。
【实验原理】
血清中含有多种蛋白质。不同种类的蛋白质其分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷的情况不同，可根据这些性质的差别，分离及提纯蛋白质。
1. 利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐中的溶解度的差异，采用盐析法进行分离。半饱和硫酸铵可使球蛋白沉淀析出，而清蛋白仍溶解在溶液中，经过离心，沉淀部分即为含γ-球蛋白的粗制品。
2. 盐析得到的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此须除去。采用凝胶层析法，利用蛋白质与无机盐之间的分子量差异，达到去盐的目的。
3. 纯化的γ-球蛋白利用醋酸纤维薄膜电泳鉴定其纯度。
【操作步骤】
1. 分段盐析：
⑴ 取血清1.0 mL加入离心管中，加磷酸盐缓冲液（PBS)1.0 mL，混匀。再逐滴加入pH 7.2饱和硫酸铵液2.0 mL，边加边摇匀。静置20分钟后离心（3000 rpm×10分钟)，倾去上清液（此液中主要含清蛋白)并尽量倒净，沉淀为球蛋白。
⑵ 将上述离心管中的沉淀用1.0 mLPBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵液0.5 mL，混匀，静置20分钟后离心（3000 rpm×10医学全.在线分钟)，倾去上清液（此液中主要含α、β-球蛋白)并尽量倒净，其沉淀为初www.med126.com/kuaiji/步纯化的γ-球蛋白。如要获得更纯的γ-球蛋白，可重复此过程1次，最后用1.0mL PBS将沉淀溶解。
2. 脱盐：
⑴ 装柱：取层析柱，关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加入葡聚糖凝胶G-25悬液，待底部沉积1 cm厚的凝胶后，打开下端出口，继续加入凝胶至凝胶沉积15 cm高，并注意保持凝胶床表面平整，然后经PBS流洗平衡。
⑵ 上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端出口开关，使柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面，关紧下端出口。用滴管吸取γ-球蛋白液，小心缓慢地沿层析柱内壁加到凝胶床表面上，注意不要破坏凝胶床表面的平整。打开下端出口，使样品进入凝胶床，小心加入少许PBS于柱内，待进入凝胶床后再加入少许的PBS，如此重复三次，以洗净柱内壁上的样品溶液，然后可加入多量的PBS进行洗脱，流速为5滴/分。
⑶ 收集：事先应准备好10支试管，于加样开始后立即收集洗脱液。每收集约1.0 mL换一管。
⑷ 检查：取瓷比色盘2个（一个为黑色背景，另一个为白色背景)，按洗脱液的管号顺序分别取1滴滴于比色盘中，前者各加10%三氯乙酸5滴；后者各加纳氏试剂1滴。将检查结果用“-，+，+”等符号记录于表中。选取蛋白含量高且不含铵离子的样品液进行纯度鉴定。
3. 纯度鉴定：
⑴ 取于巴比妥缓冲液中充分浸湿醋酸纤维素薄膜1张，用滤纸吸去多余的水分，于无光泽面点样。
⑵ 在距膜条一端约2cm处，用X光软片蘸取全血清和纯化的γ-球蛋白样品液（第3管)分别点于膜条上。
⑶ 将巴比妥缓冲液加于电泳槽内，再将点样后的膜条放置于电泳槽槽架上。放置时膜条的无光泽面应向下，点样端置于阴极，膜条与滤纸需贴紧。
⑷ 接通电源，以150V恒压电泳约45分钟。
⑸ 通电完毕后，用镊子将膜条取出，浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染色1分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直到背景漂净为止。用滤纸吸干膜条，比较纯化前与纯化后电泳图谱的变化，以确定样品的纯度。
【结果和计算】
1. 凝胶柱分离流洗结果：
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 蛋白沉淀 | - | + | ++ | - | - | - | - | - | - | - |
| 铵离子 | - | - | - | - | - | + | ++ | ++ | ++ | + |
2. 电泳鉴定结果：
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纯化前血清蛋白的醋纤膜电泳
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纯化后血清蛋白的醋纤膜电泳
【结论和讨论】
1. 电泳鉴定结果显示，血清蛋白样品经分段盐析、凝胶层析等技术方法分离纯化后得到了较纯的γ-球蛋白。因此，采用上述实验方法能够从血清中纯化γ-球蛋白。
2. 第3支试管中的收集液为蛋白含量最高且不含铵离子的样品液，因此通过凝胶层析能有效去除样品中的盐离子成分。
