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生物化学与分子生物学-实验指导:实验六 凝胶层析分离血红蛋白和维生素B2

生物化学与分子生物学:实验指导 实验六 凝胶层析分离血红蛋白和维生素B2:实验六 凝胶层析分离血红蛋白和维生素B2【实验目的】掌握层析法的基本原理;熟悉凝胶层析技术的基本操作及其应用。【实验原理】凝胶层析又叫分子筛层析,是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物,用维生素B2(黄色,分子质量为376.36)和血红蛋白(红色,分

实验六  凝胶层析分离血红蛋白和维生素B2

【实验目的】

掌握层析法的基本原理;熟悉凝胶层析技术的基本操作及其应用。

【实验原理】

凝胶层析又叫分子筛层析,是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物,用维生素B2(黄色,分子质量为376.36)和血红蛋白(红色,分子质量为64500)混合物作样品,在层析时,血红蛋白相对分子质量大,不能进入凝胶颗粒内部,而从凝胶颗粒间隙流下,所受阻力小,移动速度快,先流出层析柱;维生素B2相对分子质量小,可进入凝胶颗粒内部,洗脱流程长,因而所受阻力大,移动速度慢,后流出层析柱。这样就可达到分离维生素B2和血红蛋白的目的。收集洗脱液后,在分光光度计上测定两种组分的吸光度,绘医.学全在线制洗脱曲线。

【实验试剂和器材】

1. 试剂

⑴葡聚糖凝胶SephadexG-25或SephadexG-50。

⑵0.2%维生素B2饱和水溶液 :称取维生素B2 0.2 g,溶于少量蒸馏水,转入100 mL容量瓶,加蒸馏水至刻度。

⑶生理盐水。

⑷血红蛋白溶液:取草酸钾抗凝血2 mL置离心管中,3000r/min离心5min,使血细胞沉淀,弃去血浆及白细胞层。向红细胞沉淀加入生理盐水4 mL,振摇洗涤,3000r/min离心5min,弃去上清液。向沉淀加入蒸馏水2 mL,混匀,猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。即为上清血红蛋白溶液备用。

⑸0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2):取0.1 mol/L磷酸氢二钠720 mL和0.1 mol/L磷酸二氢钠280 mL,混匀。

2. 器材

分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶 、刻度吸管 、量筒、试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸、笔 、玻璃棉或海绵垫。

【实验步骤】

1. 凝胶准备  称取SephadexG-25 5 g或SephadexG-50 3 g,加磷酸盐缓冲液50 mL,置于水中浸泡6小时(沸水浴中溶胀2小时),用磷酸盐缓冲液漂洗,去除漂浮的细小颗粒。

2. 装柱  取直径0.8~1.2 cm长25~30 cm的层析柱一支,将层析柱出口接上乳胶管,在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫。关住层析柱出口,用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液,顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2 cm高时,打开出口,使缓冲液缓缓流出,同时继续倒入凝胶悬液,掌握倒入速度,使其与缓冲液流出速度大体相同,直至凝胶床高度达18cm时为止。关闭层析柱出口,要求凝胶床要均匀,中间要连续,不得有气泡或断纹,表面要平整。如凝胶床表面不平整,可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起,待其自然下沉,即可使表面平整。凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。

3. 样品制备  将维生素B2饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1(体积比)混匀。

4. 加样  打开层析柱出口,使缓冲液缓缓流出,当液面与凝胶床表面平齐时,关上出口。用吸管吸取待分离样品溶液约0.5 mL,在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口,使样品溶液进入柱床。然后再用滴管沿层析柱内壁加入磷酸盐缓冲液,约1cm高。加样不可过多,以免分离不完全。

5. 洗脱  将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入口,使细玻璃管的下端插入液面,但不可卫生资格考试网接触凝胶床表面。将装有磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置,使其略高于层析柱,将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上,保持密闭状态。打开下口瓶出口,然后打开层析柱出口,使磷酸盐缓冲液缓缓流出,保持4~6滴/min的流速。洗脱速度不可过快,以免区带不清晰。

6. 收集  随着层析的进行,凝胶床将出现两条明显的区带,血红蛋白区带在下,维生素B2区带在上。当血红蛋白区带即将流出时,开始收集,每管收集约1 mL,直到流出液变为无色为止,约需收集5~6管;以同样方法收集维生素B2

7. 测定  在540nm波长下,以磷酸盐缓冲液调零,测定血红蛋白和维生素B2各管吸光度。

8. 结果及分析  以管号为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制洗脱曲线。分析实验结果并说明原因。

【实验注意事项】

1.在收集过程中,要保持流出液的流速稳定。

2.加样时,保持凝胶上平面不被搅动。

3.液面要始终高于凝胶上平面,否则会导致干柱。

【思考题】

1.小结己知的分离蛋白质的生化方法有哪些?

2.盐析法沉淀蛋白质后,常用透析法脱去蛋白质中盐分,此外,你认为还可用什么方法脱盐。为什么?

 

 

 

 

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