实习五、总抗坏血酸测定（2，4-二硝基苯肼比色法)
（一)目的意义
食品中的总抗坏血酸包括还原型和脱氢型两种形式。当食物陈旧、储存日久以及经过烹调处理的食物，其中有相当一部分抗坏血酸成为脱氢型，此种形式的抗坏血酸仍有85%左右维生素C活性，因此对这类食物常常测定总抗坏血酸。
（二)原理
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸。在一定条件下，脱氢型抗坏血酸与2，4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，脎的生成量与总抗坏血酸含量成正比，将脎溶解在硫酸中后可进行比色定量。
（三)仪器和试剂
1．恒温水浴37±0.5℃。
2．可见紫外分光光度计。
3．捣碎机。
4. 4.5mol/L硫酸250ml浓硫酸（比重1.84)缓慢地加入700ml蒸馏水，冷却后用水稀释至1000ml。
5. 85%硫酸 850ml浓硫酸（比重1.84)缓慢加入150ml水中。
6. 2%2，4-二硝基苯肼溶液 溶解2g2，4-二硝基苯肼于100ml 9mol/L硫酸
内，过滤。不用时存于冰箱，每次用前必须过滤。
7. 2%草酸溶液。
8. 1%硫脲 称取5g硫脲溶解在500mll%草酸溶液中。
9. 2%硫脲 称取10g硫脲溶解在500mll%草酸溶液中。
10. 活性炭 加200g碳粉于1L盐酸溶液（1分盐酸+9分水)，加热回流1~2小时，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~1200C烘箱中干燥，备用。
11.抗坏血酸标准溶液(1mg/ml) 称取100mg纯抗坏血酸溶解于100ml l%草酸中。
（四)操作步骤
1．样品提取 均匀取样100g，剪碎置捣碎机中，加100ml 2%草酸，制成匀浆。取10～40g匀浆（含1～2mg抗坏血酸)倒入容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。过滤，滤液备用。
2．氧化 取上述滤液2.5ml加入2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10ml滤液，加入10ml 2%硫脲溶液，混匀，备用。
3．脎的形成 取3个试管A为空白管，B、C为样品管。三管中各加入4ml上述氧化后的样品液，B、C管中再各加入l.Oml 2%2，4-二硝基苯肼溶液。将所有试管放入37±0.5℃恒温水浴保温3h。取出置室温下，A管加2% 2，4-二硝基苯肼溶液l.Oml，放置10www.med126.com/sanji/～15min。
4．脎的溶解 各管置冰浴中缓慢加入85%硫酸5ml，滴加时间至少需1min，需边加边摇动试管。取出试管，室温下放置30min后比色。
5．比色用1cm比色杯，以空白液调零点，于540nm波长测吸光度。
6．标准曲线绘制 取50ml标准液于锥形瓶中，加2g活性炭，振摇1min，过滤，取滤液10ml于500ml容量瓶中，加5.Og硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度为20μg/ml。取5、10、20、25、40、50、60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1、2、4、5、8、10、12μg/ml。按样品测定步骤形成脎并比色，以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度(μg/ml)为横坐标绘制标准曲线。
（五)计算
抗坏血酸含量
式中 C：由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中抗坏血酸浓度，μg/ml。
V:试样用1%国家医学考试网草酸溶液定容的体积，ml。
F:样品氧化过程中的稀释倍数。
W:样品重量，g。
（六)说明
1．加85%硫酸溶解形成的脎时应边加边振摇试管，以防样品中糖碳化而使溶液变黑。
2．加入硫酸30min后必须立刻比色，因为颜色会继续加深。
3．硫脲可防止抗坏血酸被氧化，并有助于脎的形成。
（七)思考题
100g样品加2%草酸制成匀浆，取10g匀浆用1%草酸稀释至100ml过滤，取25ml滤液氧化后过滤，再取10ml氧化后滤液加10ml 2%硫脲溶液稀释，取4ml稀释液进行测定。测得值查标准曲线算得抗坏血酸浓度为9μg/ml，求样品中抗坏血酸含量。
