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使用 epidesigner设计引物，正向引物：5-TGATATAGTTTTGTTTTTGGATGGG-3，反向引物：5-AATAAAAACTC TCCAATACCACTTCC-3。扩增片段大小为 200～600 bp。在正向引物5端加入10 mer 标记序列，用于平衡PCR反应；反向引物5端加入 T7启动子序列，用于后续的体外转录。
2.2.2 PCR反应和产物纯化
使用 EZ 96 DNA Methylation Kit (Zymo Research公司 美国)进行亚硫酸氢盐转化反应。以转化后的DNA为模板，在384孔板进行 PCR扩增反应。每个反应总体积5ｕl，包含模板 DNA 1 ｕl （DNA浓度>5 ηg/ｕl)，5 U/ｕl Hotstar Taq酶 0.2 U，引物每条1 pmol， 25 mmol/LdNTP 0.04 ｕl，反应条件为 94 ℃ 15 min；94 ℃20 s, 62 ℃30 s， 72 ℃1 min，45 个循环；72℃ 3 min；4℃放置。PCR反应产物使用 2ｕl虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP)处理，去除体系中游离的dNTP。反应体系 7 ｕl，其中 PCR产物 5 ｕl，SAP混合液 2 ｕl(SAP 0.3 ｕl, RNase-free ddH2O 0.17 ｕl)。反应程序 37 ℃ 20 min；85 ℃ 5 min；4 ℃放置。
2.2.3 体外转录及RNase A特异性酶切反应
体外转录与酶切反应同时进行，总体积7 ｕl反应体系包含SAP处理后 PCR产物 2 ｕl，RNase-free ddH2O 3.15 ｕl， 5×T7聚合酶缓冲液 0.89 ｕl ， T裂解混合液 0.24 ｕl ， 100 mmol/LDTT 0.22 ｕl ，T7 RNA & DNA 聚合酶 0.44 ｕl ，RNase A 0.06 ｕl。反应程序为37 ℃ 3 h，4 ℃放置。 每个样品中加水20 ｕl稀释，震荡混匀，加入 6 mg 清洁树脂纯化 10 min，3 200×g离心5 min。
2.2.4 芯片点样及质谱检测
使用点样仪（型号Mass ARRAY Nanodispenser RS1000 SEQUENOM公司 美国)将纯化后产物点至384 孔SpectroCHIP (SEQUENOM公司 美国)芯片上， 将点制好的芯片放入质谱仪 （型号Mass ARRAY Compact System SEQUENOM公司 美国)进行检测。 SpectroCHIP芯片使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术（matrix-assisted laserdesorption/ionization –time of flight, MALDI-TOF)进行检测，检测数据通过EpiTYPER软件（SEQUENOM公司 美国)分析并输出结果。
2.2.5 统计学处理
对数据采用SPSS10.0 统计软件分析，行t检验。
3 结果
3.1 EYA1突变检测结果
在先天性小耳畸形患者中共检测到4 种EYA1核苷酸改变，分别为：①位于外显子3 的258G>A Q86Q（1 例散发患者，纯合突变)；②位于外显子7的 813A>G T271T（1 例家系患者和 2 例散发患者，均为纯合突变)；③位于外显子12 的 1278C>T G426G（3例家系患者杂合突变，6 例家系患者纯合突变，5 例散发患者杂合突变，9 例散发患者纯合突变)；④位于外显子 16的 1755T>C H585H（6例家系患者杂合突变，8 例家系患者纯合突变，10例散发患者杂合突变医.学全.在.线网站www.med126.com，15 例散发患者纯合突变)。其编码蛋白质均未见改变，均为单核苷酸多态（Single Nucleotide Polymorphism SNP)。
3.2 EYA1甲基化检测结果EYA1 基因启动子区域 CpG 岛(胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸相对集中区域)共 21 个位点，共分为13 个单元(Unit)， 分别为 CpG_Unit1 （位点 1， 2， 3) ， CpG_Unit2 （位点4) ， CpG_Unit3（位点 5，6，7)，CpG_Unit4（位点 8)，CpG_Unit5（位点 9，10)，CpG_Unit6（位点11，12，13)，CpG_Unit7（位点 14，15)，CpG_Unit8（位点16)，CpG_Unit9（位点 17)，CpG_Unit10（位点 18)，CpG_Unit11（位点 19)，CpG_Unit12（位点 20)，CpG_Unit13（位点21) 。 CpG_Unit8和CpG_Unit9因为分子量太小而未能检测。 CpG_Unit11， CpG_Unit12和 CpG_Unit13 分子量与不含甲基化序列分子量相同，质谱峰重叠不能检测。实验组CpG_Unit3 和 CpG_Unit5 甲基化程度较正常对照明显降低，其差异具有统计学意义；其余各CpG_Unit未见明显改变。
