 |
 |
1 材料与方法
1.1 动物与试剂雌性新西兰大白兔(购自中山大学实验动物中心)7只，体质量2.5～2.7kg。DMEM培养基、新生牛血清、小牛血清(Gibco公司，美国)、17β_雌二醇、胰蛋白酶、1_{4_[2_(n，n_二甲氨基)乙氧基]苯｝_1，2_二苯_1_丁烯(他莫昔芬)、L_硝基_左旋精氨酸甲酯(左旋_硝基精氨酸甲酯，L_NAME)、亮肽素、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、三羟甲基氨基甲烷、考马思亮兰(Sigma公司，美国);兔抗iNOS多克隆抗体(Abcam公司，中国)，兔抗caveolin_1多克隆抗体(Fharmingen公司，美国)，NO测定试剂盒(精美生物工程有限公司，中国)，其它试剂为国产分析纯。
1.2 VSMCs培养
利用组织块贴壁法培养兔胸主动脉VSMCs。待细胞长满瓶底后加入质量分数2%的胰蛋白酶消化传代。用4～6代细胞进行实验。实验用VSMCs选用SABC免疫组化法α_actin抗体进行鉴定。
1.3 MTT比色法检测活细胞数量
将VSMC接种于96孔板上，用无酚红无血清DMEM培养液培养24h。在新生牛血清促增殖实验中，加入体积分数10%的新生牛血清继续培养24h。在17β_雌二醇抑制增殖实验中，加入不同浓度17β_雌二醇提前孵育24h后，再加入10%新生牛血清继续培养。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)37℃孵育4h后，倾倒培养液，加入二甲基亚砜终止反应，酶标仪于570nm处测量吸光度。在17β_雌二醇孵育细胞之前，加入他莫昔芬(10_7mol/L)，或iNOS阻断剂L_NAME(10_6mol/L)，或caveolin_1蛋白阻断剂β_MCD(10_3mol/L)提前孵育2h。
1.4 免疫印迹法检测蛋白表达
培养细胞于6孔培养板中经过不同药物处理后，加入0.1mL蛋白提取液裂解细胞，收集提取液，离心后取上清液Bradford法测定蛋白质质量浓度，并进行SDS_PAGE电泳，电印迹转移至硝酸纤维素膜上，分别与一抗(兔抗iNOS多克隆抗体(稀释度1∶50)，兔抗caveolin_1多克隆抗体(稀释度1∶100))和二抗孵育，与ECL试剂反应1min后，X光胶片压片曝光，用IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度，并进行积分处理，以对照组为100%进行统计分析作图医.学全.在.线网站www.med126.com。
1.5 VSMCs中NO浓度测定
采用NO测定试剂盒，比色法测定。VSMCs经影响因子处理后，取细胞培养上清液100μL，加入磷酸盐缓冲液和硝酸还原酶，37℃孵育1h，加入显色剂后530nm波长测定吸光度。NO(μmol/L)=测定管OD/标准管OD×100μmol/L。
1.6 统计学处理
数据以±s表示。用SPSS11.0统计软件，以单因素方差分析，组间比用t检验。
2 结果
2.1 不同浓度17β_雌二醇对10%新生牛血清诱导的VSMCs活性增加的影响MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，实验中活细胞数量多少可反映细胞增殖情况。从图1可以看出，10%新生牛血清处理VSMCs 24h后，细胞活性比正常对照组的明显增加(n=6，P<0.05)。提前用10_5～10_10 mol/L的17β_雌二醇预处理VSMCs 24h，均可抑制10%新生牛血清诱导的VSMCs增殖，其作用以10_8mol/L 17β_雌二醇最明显(n=6，P<0.05)。
与正常对照组比 ^P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.052.2 不同阻断剂对17β_雌二醇抑制VSMCs活性增加的影响提前用17β_雌二醇受体阻断剂他莫昔芬(10_7mol/L)孵育细胞2h，结果显示，他莫昔芬预处理可部分逆转17β_雌二醇对VSMCs增殖的抑制(n=6，P<0.05，图2)。β_MCD提前孵育2h，与17β_雌二醇孵育组比，10_5mol/L β_MCD可部分阻断17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6，P<0.05)。为探讨iNOS在17β_雌二醇抑制VSMCs增殖中的作用，我们选用L_NAME提前孵育细胞，结果显示，L_NAME提前孵育后与17β_雌二醇孵育组比，细胞活性明显增高，提示，L_NAME可部分阻断17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6，P<0.05)。他莫昔芬、β_MCD或L_NAME单独孵育对VSMCs增殖无影响。
图2 他莫昔芬，β_MCD，L_NAME对17β_雌二醇抑制VS_MCs活性的影响(n=6。1正常对照组 210%新生牛血清组 310%新生牛血清+17β_雌二醇组 410%新生牛血清+17β_雌二醇+他莫昔芬组 5他莫昔芬组 610%新生牛血清+17β_雌二醇+β_MCD组 7β_MCD组 810%新生牛血清+17β_雌二醇+L_NAME组 9L_NAME组)
