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医学论文范文:人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制
【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs)体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制. 方法： 从骨髓中分离培养MSCs，反复贴壁进行纯化；用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞；观察MSCs对植物血凝素（PHA)刺激下T淋巴细胞增殖的影响，用ELISA方法检测IFNγ，IL4水平变化. 结果： MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用，并呈剂量依赖性；同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFNγ分泌，但可促进IL4的分泌. 结论： MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFNγ和IL4有关.
【关键词】 骨髓间充质干细胞；T淋巴细胞；免疫调节；干扰素γ；白细胞介素4
0引言
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中不同于造血干细胞的另一类成体干细胞，这类细胞易于采集、分离和体外扩增，除具有高度增殖及多向分化潜能、促进机体造血重建外，还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植排斥等免疫调节作用，但具体机制还不清楚. 为进一步探讨MSCs的免疫调节功能，我们研究了MSCs对T淋巴细胞增殖及其分泌IFNγ与IL4的影响.
1材料和方法
1.1骨髓MSCs的分离、培养与鉴定抽取肝素抗凝的健康供者骨髓20 mL（n=10)，DMEM（Gibco)倍比稀释，Ficoll分离液（天津灏洋)2000 r/min,15 min条件下分离出单个核细胞，DMEM洗涤2次，完全培养基（100 g/L胎牛血清+ DMEM)重悬细胞，以2×109/L接种于25 cm2培养瓶内，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，24 h首次换液，以后每2～3 d换液1次，细胞融合度达80%时消化传代培养，流式细胞仪分析检测传至3代MSCs的纯度医.学全.在.线网站www.med126.com.
1.2外周血T淋巴细胞的分离与纯度鉴定取新鲜肝素抗凝人外周血20 mL，Ficoll分离液（2000 r/min,15 min)分离出单个核细胞，尼龙棉柱法进一步分选T淋巴细胞，流式细胞仪分析尼龙棉柱分离前后T淋巴细胞的纯度.
1.3MSCs对植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)作用下的T淋巴细胞增殖的影响取第3代培养的MSCs，经60Co照射30 Gy，调整细胞密度，按细胞数分为3组，A组1×103个，B组1×104个，C组1×105个，每组设单独同等数量MSCs为空白对照，以单独T淋巴细胞培养为阳性对照. 以终体积100 μL／孔，加入96孔培养板内，MSCs完全贴壁后吸去上清或更换培养液，并除空白对照外各组加入T淋巴细胞1×104/孔. 经PHA 5 μg（Sigma)作用68 h后加入20 μL／孔MTT（Sigma)继续孵育4 h，弃上清后二甲基亚砜固定，酶标仪490 nm处测定A值，增殖百分率=（实验组A值-对照组A值)/实验组A值.
1.4MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞IFNγ，IL4分泌的影响分别用1×107/L，1×108/L MSCs与1×109/L的T淋巴细胞共培养，同时加入5 μg 的PHA. 应用IFNγ，IL4试剂盒（武汉博士德)检测各组培养上清中IFNγ和IL4浓度.
统计学处理：应用SPSS软件进行统计分析，实验结果用x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnettt检验，P<0.05为有统计学差异.
2结果
2.1MSCs与T淋巴细胞纯度鉴定原代MSCs形态均匀一致，呈长梭形，流式细胞仪结果显示：传至3代MSCs高表达CD29，CD44和CD13，而CD34，CD45，HLADR低或极低表达，纯度达90%以上；异体外周血单个核细胞经尼龙棉柱分离后CD3+细胞百分比达98%以上.
2.2MSCs抑制T淋巴细胞的增殖MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞增殖呈抑制效应，并呈剂量依赖性. 单纯RPMI1640培养基条件下，T淋巴细胞阳性对照组的增殖率为（77.05±1.94)%，A，B，C组依次为（44.94±5.84)%，（33.45±7.00)%，（17.64±4.59)%，与阳性对照组比较均有统计学差异（P<0.05).
2.3MSCs抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ为（79.16±13.40)ng/L，与1×107/L，1×108/L的MSCs共培养时IFNγ的分泌分别为（25.54±7.05)，（9.55±3.60)ng/L，IFNγ分泌明显减少（P<0.05).
2.4MSCs促进T淋巴细胞IL4的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量为（46.04±9.67)ng/L，加入1×107/L，1×108/L MSCs后，IL4的分泌增加，分别为（67.10±11.44)，（97.92±19.48)ng/L，与单纯T淋巴细胞培养组比较差异具有统计学意义（P<0.05).
