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[Key words] Polysialic acid neural cell adhesion molecule; DNA methylation; Epigenetics; Synaptic plasticity
多聚唾液酸(PSA)是线形同聚物构成的多糖，其作用是通过神经细胞黏附分子(NCAM)介导。因此，描述PSA时，通常以PSA-NCAM的形式。PSA-NCAM在整个神经系统的发育过程中都有重要作用，如神经前体细胞的迁移[1]，神经细胞的分化，突触的可塑性和空间记忆的形成[2]，轴突旁路的形成[3]。本研究通过在基因水平和蛋白水平对能催化PSA合成的两种多聚唾液酸转移酶- ST8SiaII(STX)和 ST8SiaIV(PST)研究发现，调控这两种酶表达的基因转录起始区富含GC，而且还包含SP-1蛋白识别序列，同时这个识别序列也包含了CpG 序列[4]，甲基化能够用来作为多聚唾液酸表达的基因外调控。
1 材料与方法
1.1 材料：组织基因组DNA提取试剂：QIAGEN公司(JP);细胞基因组DNA提取试剂：GENTRA 公司(USA);鼠抗 PSA-NCAM单克隆抗体：CHEMICON INTERNATIONAL，Inc(USA)。免疫纯化的生物素连接的山羊抗鼠 IgG+IgM抗体：Pierce Biotechnology，Inc(USA)。18d的胚胎鼠(E18)和成年小鼠C57BL/6J(山犁大学医学部动物研究中心)各50只，体重分别为100-250g。小鼠Neuron2A细胞株：山犁大学医学部环境遗传医学教室。胎牛血清和dulbeccos modified eagles medium(DMEM)来自SIGMA公司。蛋白定量试剂盒：Dojindo Molecular Technologies，Inc(JP);WizardTM DNA clean-up System：promega 公司。其他试剂购自SIGMA公司。
1.2 方法
1.2.1 小鼠神经纤维母细胞瘤的细胞株-Neuro2A，细胞培养及神经细胞和神经胶质细胞的原代培养：小鼠成纤维母细胞瘤的细胞株-Neuro2A，细胞常规复苏后,以104/cm2的密度接种于培养皿，培养液含10%(v/v)胎牛血清和青霉素/链霉素(100μg/ml)的DMEM，置37℃，5% CO2培养箱中培养。细胞培养24h后，加入终浓度为1mM的视黄酸(retinoic acid)，48h后观察细胞的分化情况，细胞80%融合后传代。再加入不同浓度的丙戊酸和甲硫氨酸，48h后收集细胞，提取蛋白。
1.2.2 神经细胞和神经胶质细胞的原代培养：取18d的胚胎鼠(C57BL/6J)大脑皮层细胞分别培养在神经细胞培养液和神经胶质细胞培养液，大约2周后，细胞呈现互相连接生长。分别收集神经细胞和神经胶质细胞，提取蛋白。
1.2.3 蛋白提取：分别收集Neuro2A，神经细胞和神经胶质细胞，冷PBS洗涤细胞3次，用预冷的细胞裂解液(1% Triton X-100和1%的蛋白酶抑制剂)100μl裂解细胞(5000rpm，5min)，超声波使溶液均匀透明 ，考马斯亮蓝(lowry)法测定蛋白浓度医.学全.在.线网站www.med126.com。
1.2.4 DNA提取：分离成年鼠和胚胎鼠的大脑、小脑、基底核、海马，加入Proteinase K，55℃过夜消化，苯酚—氯仿抽提，酒精沉淀，干燥， TE溶解，紫外分光光度仪测量DNA浓度。
分别收集Neuro2A，神经细胞和神经胶质细胞，冷PBS洗涤细胞5次，加入细胞裂解液，震荡，再经过RNase A处理和蛋白沉淀，异丙醇抽提，酒精沉淀，TE溶解，紫外分光光度仪测量DNA浓度。
1.2.5 PSA合成的甲基化分析—甲基化特异性的PCR (methylation-specific PCR)：上述提取的DNA，经过亚硫酸盐处理后作为模板进行PCR扩增反应，引物的设计围绕SP-1蛋白结合位点(引物序列见表1)。采用甲基化特异性的PCR 检测了STX和PST基因转录其始区是否发生甲基化[5]。
