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小鼠颈椎脱臼处死后，放入750mL/L的酒精内浸泡5min。无菌条件下取出双侧股骨，去除附带组织，两端剪断暴露骨髓腔。用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液及1号针头反复冲洗，将骨髓腔内的骨髓冲出，并用1号针头反复抽吸，制成单细胞悬液，充分混匀，转入离心管，1500r/min离心5min弃上清及脂肪层，沉淀用DMEM培养液充分混匀，用吸管轻轻叠加到密度为1.077g/mL的Ficoll-Paque分离液上，2500r/min离心10min，取界面层的单核细胞，再用DMEM培养液多次洗涤，离心后备用。细胞沉淀以5×105个/cm2密度接种于培养瓶，加入DMEM完全培养液置于37℃，50mL/L CO2，80%相对湿度的培养箱中，2d后全量换液，去除未贴壁的细胞，以后每隔3d换液1次，倒置相差显微镜逐日观察细胞的形态，贴壁情况及生长情况。待细胞融合达80%，胰酶37℃消化，进行传代、扩增培养。取培养第2代的细胞用PBS洗涤3次，胰酶消化成单细胞悬液，将细胞悬液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀PBS洗涤3次，分别加入荧光标记的抗体，4℃孵育30min，PBS洗去未标记抗体，10g/L多聚甲醛固定，应用FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。
1.3 建立体外非接触共培养实验模型
参照本实验室的方法建立小鼠肺损伤模型[4]，并参照POPOV等[3]方法建立体外非接触共培养实验模型，实验模型图见图1。无菌条件下分离提取无肺损伤肺组织(共25只小鼠)、肺损伤模型肺组织(共25只小鼠)。制备肺组织单细胞悬液。将约5×104个/mL的小鼠肺细胞接种于0.4μm孔径(Millpore)大小的膜上(悬挂式体外共培养小室)，并放入24孔板中，在24孔板的底部同时放上适当大小的载玻片，并接种约5×104个/mL小鼠骨髓来源间充质干细胞(MSCs)。共设计三组，每组6孔：对照组：MSCs单独静置培养;实验组A： 正常健康肺组织单细胞悬液(上室)+MSCs(下室);实验组B：损伤组肺组织单细胞悬液(上室)+MSCs(下室)细胞。共同培养8d，每日倒置相差显微镜下观察细胞形态，贴壁情况及生长情况。
1.4 激光共聚焦显微镜检测表面蛋白C(surfatcant protein C, SP-)和水通道蛋白5(aquaporin protein 5, AQP-5)的荧光表达医学全.在线www.med126.com
在共培养的第8天，根据以下步骤处理细胞标本：①将共培养中接种有MSCs的载玻片取出，40g/L的多聚甲醛固定10min，0.01mol/L PBS漂洗3～5次;②在同一培养皿中分别加入PBS稀释抗-SP-C(1∶100)一抗和抗-AQP5(1∶100)，湿盒内4℃孵育24h，0.01mol/L PBS漂洗3次;③加入FITC标记和TRITC标记的抗兔IgG(1∶100)，37℃孵育2h，0.01mol/L PBS漂洗3次;④0.01mol/L PBS充分洗涤后加入终浓度为10mg/L Hoechst 33342约1mL，室温孵育20min;以抗体稀释液代替单克隆抗体作为阴性对照试验。⑤0.01mol/L PBS充分洗涤后用VECTASHIELD Mounting Medium封片，采用激光共聚焦显微镜观察SP-C、AQP5的荧光表达情况。
1.5 RT-PCR 检测非接触共培养体系模型下室中的SP-C和AQP5 mRNA
1.5.1 总RNA的提取
RNA抽提试剂盒为Qiagen公司产品，具体操作按照试剂盒说明书。
1.5.2 cDNA第一链合成反应
20μL反应体积中含2μL 10×PCR buffer、2μL 2mmol/L dNTP、4μL 25mmol/L MgCl2、0.5μL RNase抑制剂、2μL RNA模板、1μL oligo dT引物、7.5μL无RNase水，反应条件为：50℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。
1.5.3 PCR扩增反应
通过对AQP-5和SPC基因组DNA序列分析，用计算机辅助生物软件Primer 5.0(Applied Biosystem, Inc.Co.)设计了两对引物，AQP-5:Forward(5′-3′)：TGTCGTCGTGGTGATTGTA;Reverse(5′-3′)：ACTGTGCCCTTCTTCCTG。预计扩增片段长为355bp;SPC：Forward(5′-3′)：GAGCCAGTTTCGCATTCC;Reverse(5′-3′)：CAGGTCTCGCCCAGAAGA。预计扩增片段长为463bp。引物由上海生工合成。PCR反应体系包括：每种dNTP 250μmol/L，MgCl2 2.5μmol/L，10×PCR缓冲液5μL，Taq酶5u，反转录产物3μL，引物0.1μmol/L/条，终反应体系50μL。PCR反应在PX-2型PCR仪上进行，AQP-5循环条件为：95℃ 10min;94℃ 60s，48℃ 90s，72℃ 60s，35个循环;72℃ 10min。SPC循环条件为：95℃ 10min;94℃ 60s，50℃ 90s，72℃ 60s，35个循环，72℃ 10min。取5μL产物经12g/L琼脂糖电泳，鉴定产物的特异性。最后将所获得的PCR产物利用GeneTools(SynGene公司，版本：3.07)进行产物量的测定(丰度图结果未显示)。
1.6 统计学处理
所有数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0统计软件包对数据进行统计分析，实验结果均数之间比较采用General Lineral Model(GLM)模型进行析因多因素方差分析，P<0.05为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、纯化、扩增和鉴定
骨髓单核细胞悬液接种于塑料培养瓶后，细胞在培养瓶底散在分布，呈圆形，48h后完全换液，去除未贴壁的血细胞。此时贴壁的细胞为单个或几个细胞的克隆，细胞形态均一，为长梭形。培养至10～12d，细胞接近融合，每个克隆约数百至数千个细胞，集落之间细胞出现重叠，细胞形态均一，随着培养时间的延长，旋涡中心的细胞可形成多细胞层，细胞界限不清，黏附于贴壁细胞之上的杂细胞在换液的过程中逐渐被清除。传代后的MSCs增殖生长仍然迅速，生长潜伏期较短，7～10d即达到完全融合(图2)。流式细胞仪结果显示二代细胞均一性在95%以上，CD34、CD45表达为阴性，证明这一类细胞为非造血类细胞。CD105、CD106表达阳性(图3)。
2.2 激光共聚焦显微镜检测SP-C和AQP5的荧光表达
于共培养的第8天处理标本，然后用激光共聚焦观察各处理组共培养下室中的免疫荧光表达情况。对照组只检测到MSCs的蓝色荧光和AQP5的红色荧光(图4A)。实验组A也只检测到MSCs的蓝色荧光和AQP5的红色荧光(图4B)。实验组B可同时检测到MSCs的蓝色荧光，AQP5的红色荧光，以及绿色的SP-C的荧光(图4C、图4D)。
2.3 共培养体系下室中的SP-C和AQP5 mRNA的表达情况
