| 公开(公告)号 | CN1513999A |
| 公开(公告)日 | 2004.07.21 |
| 申请(专利)号 | CN03127082.4 |
| 申请日期 | 2003.06.18 |
| 专利名称 | 一种新的蚓激酶基因突变体 |
| 主分类号 | C12N15/58 |
| 分类号 | C12N15/58;A61K38/49;A61K31/7088;A61P7/02 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 中国人民解放军军需大学军事兽医研究所 |
| 发明(设计)人 | 张守峰;扈荣良;涂长春 |
| 地址 | 130062吉林省长春市西安大路175号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 |
| 代理人 | 王薇 |
| 国省代码 | 吉林;22 |
| 主权项 | 一种新的蚓激酶基因突变体，在保持编码氨基酸序列不变的前提下，对经反转录获得的蚓激酶cDNA序列中的真核细胞罕用密码子进行了突变改造，具体步骤如下：(1)在冰上将突变引物各10pmol、带MgSO4的10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 2nmol、含蚓激酶cDNA的质粒pMD18-LK(3.6kb)100ng和pfu DNA聚合酶5U加入100μl PCR反应管，加入去离子水补足至体积50μl，混匀后，在ABI-2700 PCR仪上进行PCR反应，参数为：95℃预变性3min后进入循环，95℃变性1min→55℃退火1min→68℃延伸7min，25个循环后，68℃延伸15min，降温至4℃，结束PCR反应；(2)在50μl PCR产物内加入NEB Dpn I限制性内切酶2μl(20U)，37℃水浴消化1h，取其中0.8μl，在冰上与30μl DH10B感受态大肠杆菌充分混匀，以1300V电压电激转化后，于1ml 37℃ LB培养基中低速振荡培养1h，涂布氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，过夜培养后，以无菌牙签挑取单菌落，置10ml含适量氨苄青霉素的LB培养基内增菌，12-16h后小量提取质粒供测序鉴定使用。 |
| 摘要 | 本发明涉及一种新的蚓激酶基因突变体，是以单步多位点突变多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reation，PCR)方法对经反转录获得的蚓激酶cDNA(complementary DNA)进行了突变，获得了一个新的蚓激酶基因突变体。该突变体含有18个突变的碱基，但碱基突变后由其编码的氨基酸序列不改变，突变的目的是使蚓激酶有利于在哺乳动物组织和细胞内表达。突变后的蚓激酶cDNA可在哺乳动物细胞中高水平表达出具有纤溶活性的蚓激酶。表达的蚓激酶纤维蛋白溶解活性高。 |
| 国际公布 |
