| 公开(公告)号 | CN100363485C |
| 公开(公告)日 | 2008.01.23 |
| 申请(专利)号 | CN200410027944.4 |
| 申请日期 | 2004.07.07 |
| 专利名称 | 制备重组人粒细胞集落刺激因子用工程菌的发酵方法 |
| 主分类号 | C12N1/20(2006.01)I |
| 分类号 | C12N1/20(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 深圳新鹏生物工程有限公司 |
| 发明(设计)人 | 李政海;李 静;李继东 |
| 地址 | 518057广东省深圳市南山区高新技术园北区郎山二路 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 深圳市博锐专利事务所 |
| 代理人 | 张 明 |
| 国省代码 | 广东;44 |
| 主权项 | 一种制备重组人粒细胞集落刺激因子用工程菌的发酵方法，所述工程菌为DH5α-PBV220-hGCSF，其发酵过程包括种子液培养和分批补料发酵，其特征在于： 所述种子液培养包括以下子步骤： 1)菌种的筛选：从菌种保存库中取出所述工程菌，划LB平板30℃培养过夜，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB试管中培养，至OD600值为0.4-0.6，再于42℃培养4小时，离心收集菌体，SDS-PAGE分析，用重组人粒细胞集落刺激因子表达量最高的克隆作为发酵用种子，分装甘油保存，每批发酵取用一支； 2)一级种子液培养：将种子按2％的体积比接种到含2YT种子培养基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min摇床培养，至OD600值为0.6-1.0； 3)二级种子液培养：将一级种子液以1％的体积比接种到含200ml 2YT种子培养基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，摇床培养12-16小时，至OD600值为3.5-6.5，镜检无杂菌，菌种形态正常，即为发酵用种子； 所述分批补料发酵包括以下子步骤： A.发酵前的准备：将8L发酵培养基接入到20L的发酵罐中，115℃灭菌30分钟； B、基本发酵：灭菌后，待培养基温度降到30℃时，按接种量10％体积比接入二级种子液，30℃，培养8小时，开始诱导表达； C、诱导发酵：诱导温度为42℃，诱导4小时，结束发酵； 上述分批补料发酵子步骤B和C中，通过补加4mol/L氢氧化钠控制pH为7.0-7.1，通过调节发酵罐的空气流速和转速，控制溶氧值为50％；并且当OD600值为2时，开始补料，补料方式为每小时补加补料I和II各100ml； 所述补料I的配方为：葡萄糖300g，硫酸铵50g，加纯化水定容至1L； 所述补料II的配方为：酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，维生素B1 0.1g，加纯化水定容至1L。 |
| 摘要 | 一种制备重组人粒细胞集落刺激因子用工程菌的发酵方法，所述工程菌为DH5α-PBV220-hGCSF，其发酵过程包括种子液培养，包括以下子步骤：①.菌种的筛选；②.一级种子液培养；③.二级种子液培养；和分批补料发酵，包括以下子步骤：①.发酵前的准备；②.基本发酵：按接种量10％体积比接入二级种子液，30℃，培养8小时，开始诱导表达；③.诱导发酵：诱导温度为42℃，诱导4小时，结束发酵；上述分批补料发酵子步骤②和③中，控制pH为7.0-7.1，溶氧值为50％；并且当OD600值为2时，开始补料，每小时补加一定量的补料Ⅰ和Ⅱ。本发酵方法，为解决人粒细胞集落刺激因子制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、活性偏低以及成本偏高等问题提供了可能。 |
| 国际公布 |
