实用免疫细胞与核酸:第二节　DNA的变性与复性

一、DNA变性

DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等)，称为DNA变性。加热、改变DNA溶液的pH、或受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素的影响，均可使DNA变性。

通常，可利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程。因为DNA在260nm处有最大吸收值这一特征是由于含有碱基组成的缘故，在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect)。见图18-2。

图18-2 DNA的增色反应

如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线（见图18-3)，由图可见当温度升高到一定范围时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，其吸光度也无明显变化。由此说明DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生，增色效应是爆发式的。从而也说明当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的。通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度)，由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature, Tm)。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。

图18-3 DNA的Tm值

综上所述，Tm值和增色效应是目前描述DNA特性所常用的两个量。假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变性后消光系数上升30%以上；如果DNA原先局部就处于单链状态（例如在分子末端)，则变性后上升较少。增色效应的大小是DNA性质的一个简单指标，与分子量无关。Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH、离子强度和DNA的碱基比例。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。在某一离子强度（～10^-3M)以下，无需加热就使溶于其中的DNA出现不可逆变性。与A-T碱基配对比较，DNA双螺旋内的G-C配对更为牢固。在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。

假定在一个双链DNA分子内某些片段含有较多G-C碱基对，根据它们局部Tm值差，用电子显微镜就可以观察和测量到这些片段，如在DNA某一片段内含有较多的A-T碱基对，在某一个温度时就可能出现双链解离的现象。但在同一温度下，含G-C对较多部分仍然保持双链结构。这是一种非常有用的技术。

DNA的Tm值与以下因素有关：

（1)DNA的均一性：均一DNA如病毒DNA，解链发生在很窄的范围内，而不均一的DNA如动物细胞NDA其Tm值的范围则较宽。

（2)DNA分子中（G+C)的含量：一定条件下DNA的Tm值，由G+C含量所决定，因为G+C之间有3个氢链，因此G+C含量较高的DNA，Tm值较高，二者的关系可用以下经验式表示：

%（G+C)=（Tm-63.0)×2.44

www.med126.com/shouyi/实验表明DNA分子中（G+C)www.med126.com/yaoshi/克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系，见图18-4。

图18-4 DNA和Tm值与G-C含量的关系

（3)溶剂的性质：Tm不仅与DNA本身性质有关，而且与溶液的条件有关，通常溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽，离子强度增高时，Tm值长高，融点范围也变窄。因此，DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/l NaCl溶液中较稳定。

二、复性

变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation)。通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低25～30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性（图18-5)。

图18－5　热变性过程和两种冷却过程示意图

影响复性速度的因素很多，同样条件下，DNA顺序简单的分子复性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究，可以了解DNA顺序的复杂性。DNA片段的大小也影响变性的速率，因为DNA片段愈大，扩散速度愈低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在复性实验中，有时将DNA切成小片段，再进行复性。同样条件下，同一种DNA浓度愈高，复性速度也愈快。溶液的离子强度对复性速度也有影响，通常盐浓度较高时，复性速度较快。

Doty研究小组是最早对DNA变性过程进行深入研究的。它们所获得的结果表明，在达到Tm值时，两条DNA单链分离开。如果在加热之后慢慢地冷却，则出现部分复性，即DNA的一部分回复到双螺旋结构。复性的程度取决于DNA浓度及信息含量的多少。病毒DNA（信息含量少)比哺乳动物DNA容易复性，而DNA浓度较高时，有利于复性，快速冷却使DNA仍然处于变性状态，这时自由单链成链线团结构。对这种情况，人们称之为螺旋-线团转化过程（helix-coil-transition)。快速冷却时消光系数固然有所下降，但比天然DNA的数值始终要大。

细胞核DNA复性的动力学研究指出，DNA内很少片段有重复的或很相似的碱基顺序（所谓重复DNA)。DNA复性的程度和过程与其信息含量的多少等有关；因而病毒DNA比细菌DNA复性得快。Britten发现一种测定和观察复性过程的方法。X轴表示变性DNA原始浓度（Co)和保温时间的乘积，纵轴表示DNA复性部分（重新作为双螺旋结构出现)。DNA比例可以用羟基磷灰石柱的办法加以确定，因为这种柱能够使单链和双链DNA分离开来。DNA复性曲线呈S形，随着信息含量增加，此形状相同曲线往往较高Co.t值处移动。奇怪的是，从细胞核来的DNA在复性时显示出完全不同的情形：这些DNA中的一部分异常快地复性，而另一些DNA只有在极高的Co.t值时才出现预期的复性。对快速复性可以作这样的解释，即在某一DNA之内同时有几个相同或很类似的顺序存在，因而找重复顺序比找DNA内唯一顺序要快得多。后者含有特殊的遗传信息，常被称为独特DNA。与之相反是重复DNA片段。

真核DNA自发复性的一种特殊途径是通过发夹结构。对单链而言，要生成这种发夹结构，要求一种特定的碱基顺序，这种顺序称作回文（正读反读都相同)结构。为了构成回文结构，DNA片段的碱基顺序必须在互补链内找到相反的顺序；在具有相反碱基顺序的两个DNA片段之间，显然常常出现短的中间片段由于存在这样的核苷酸顺序，在复性时就能形成发夹结构。

如果存在很多重复回文结构，在部分复性时就能通过形成DNA侧链而出现十字结构。DNA回文结构使DNA片段出现回旋对称性。这种结构常常出现在DNA和蛋白质之间相互作用的地方，特别是后者起控制作用时。