一、质粒DNA的提取及鉴定
（一)质粒DNA的提取及鉴定
1．收获细菌
（1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。
（2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。
（3)吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
2．碱裂解法小量抽提质粒
（1)将细菌沉淀[上述步骤（3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中，剧烈振荡。
（2)加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS)，缓和振荡，水浴5min。
（3)加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)，缓和振荡，冰浴5min。
（4)4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。
（5)可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4)。
（6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。
（7)4℃以12000g离心5min。
（8)小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。
（9)用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。
（10)加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶)，振荡，贮存于-20℃。
（二)质粒DNA的大量制备
（1)同上1.（1)
（2)将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。
（3)加氯霉素（170μg/ml)扩增，37℃温箱中培养过夜。
（4)收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。
（5)加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。
（6)加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。
（7)加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。
（8)取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。
（9)15000rpm 4℃ 离心20min。
（10)弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min)。
（11)用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。
（12)加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。
（13)分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。
（14)加等体积氯仿/异戊醇（24：1)混匀，同样离心收集上清。
（15)加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。
（16)10000rpm 4℃离心20min。
（17)弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
（18)离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。
（三)质粒DNA的鉴定
1．酶切反应
（1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。
（2)取反应物点样，观察酶切效果。
（3)酶切完全后，70℃5min终止反应。
2．琼脂糖电泳
（1)配制所需浓度琼脂糖凝胶。
（2)在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。
（3)打开电源开关，5V/cm电泳。医学全在线网站www.med126.com
（4)在UV灯下观察电泳结果。
二、DNA的重组
（一)DNA的酶切与连接
（1)酶切反应
同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。
（2)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。
（3)15000rpm离心15min，弃上清。
（4)加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
（5)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
（6)测定DNA的含量。
（7)加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。
（8)连接反应液可置-20℃保存，供转化用。
（9)关于待插入DNA片段的获得参见附注。
