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免疫学实验指导-实验五 其它免疫学试验

免疫学实验指导:实验五 其它免疫学试验:第五部分 其它免疫学试验实验一 结核菌素试验【原理】结核菌素试验是最常用的迟发型超敏反应皮肤试验,是体内测定机体细胞免疫功能状态的方法之一。结核菌素是结核杆菌的菌体成分,注入机体后,如受试者曾经受过结核杆菌的感染,则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合,释放淋巴因子,在注射局部形成迟发型超敏反应性炎症,出现红肿、硬结。如受试者未受过结核杆菌的感染或未接种过BCG,则无超敏反应发生。故结核菌素试验可用来

第五部分  其它免疫学试验

实验一  结核菌素试验

原理

结核菌素试验是最常用的迟发型超敏反应皮肤试验,是体内测定机体细胞免疫功能状态的方法之一。结核菌素是结核杆菌的菌体成分,注入机体后,如受试者曾经受过结核杆菌的感染,则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合,释放淋巴因子,在注射局部形成迟发型超敏反应性炎症,出现红肿、硬结。如受试者未受过结核杆菌的感染或未接种过BCG,则无超敏反应发生。故结核菌素试验可用来测定机体是否有过结核杆菌的感染或BCG的接种效果,亦可用于检测机体的细胞免疫功能状态。此外用动物检查结核标本时,在接种前或后也常用此试验来测定动物对结核杆菌的感染状况。

材料

   豚鼠(约250克)、旧结核菌素、注射器、碘酒、酒精、针头等。

方法

1.取白色豚鼠(约250克),从皮下接种卡介苗1~2次,一个月后取同一豚鼠,剃去腹部一部分毛,用碘酒、酒精消毒后,于皮内注射0.1毫升11000稀释的结核菌素。

2.注射后72h观察结果。

结果

注射部位有红肿、硬结,其直径超过1cm时,即为阳性反应;无任何变化者,则为阴性反应。

注意事项

 1.本试验不宜用于结核活动期患者,特别是结核活动期婴幼儿。

2.常规试验阴性者,可分别再用1∶1000、1∶100旧结核菌素作皮试,若仍为阴性者方可判断为阴性反应。

思考题

为什么结核菌素试验可用于检测机体的细胞免疫功能状态?

                     

实验二  实验动物过敏症

实验动物过敏症属于Ι型超敏反应,与临床常见的青霉素和异种动物血清引起的过敏性休克相似,通过实验可进一步加深对Ι型超敏反应机理的理解,提高医护人员对人类过敏性休克重要性的认识。

原理

 先给动物注射异种蛋白,经过一定时间后,动物产生的IgE类抗体结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上,动物处于致敏状态。当第二次给动物注射较大量相同抗原时,抗原与IgE结合,导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放活性介质,作用于效应器官,产生严重的过敏性休克。

材料

1.动物  豚鼠(250克左右)。

2.抗原  人血清、鸡蛋清。

3.无菌注射器、针头、碘酒、酒精等。

方法

1.取健康豚鼠2只,以 甲、乙编号,分别从甲、乙2 只豚鼠的腹腔或皮下注射1∶10稀释的人血清0.1毫升,使动物致敏。

2.致敏后14~21d,取甲豚鼠给以心脏注射未稀释的人血清1~2毫升,乙豚鼠给以心脏注射未稀释的鸡蛋清1~2毫升。

3.注射后,1~5分钟观察动物的状态。

结果

1.注射人血清者经几分钟后,即出现烦燥不安,抓鼻、耸毛、咳嗽、打喷嚏等现象,继而发生呼吸困难、大小便失禁,全身倒向一侧,休克死亡。而注射鸡蛋清者无任何症状出现。

2.豚鼠解剖观察肺脏的变化,可见甲豚鼠肺脏极度气肿,而乙豚鼠

肺脏正常。

注意事项

 1.致敏途经除皮下外,还可以釆用腹腔免疫,一般在注射后2~3周,动物即可达到高致敏状态,并可维持几个月。在此期间用相同抗原进行再次注射时,可引起休克反应。

2.作抗原再次注射时,应采用静脉或心内注射的途径,使抗原直接进入循环,才能引起明显的休克反应,如采用腹腔或皮下注射,只能产生延缓性休克,甚至不发生休克反应。

   【思考题

结合动物实验,解释Ι型超敏反应发生的机理,并说明为什么乙豚鼠无超敏反应发生?

                     

实验三 溶血空斑试验

   【原理

溶血空斑试验(Plaque Forming Cell assay, PFC试验),是体外检查和计数产生IgM(直接法)和其他类型Ig(间接法)的抗体生成细胞的一种方法。具有特异性高、筛检力强、能直接观察等优点,可作为判断机体体液免疫功能的指标之一。直接法是取经SRBC免疫后第4天的小鼠脾脏,制成脾细胞悬液后,加入SRBC和补体一起混匀于琼脂糖液中,于37℃温育后,淋巴细胞释放溶血素(抗SRBC抗体),溶血素与周围的SRBC结合,在补体参与下导致细胞周围的SRBC溶解,在淋巴细胞周围形成一个肉眼可见的透明溶血圈(溶血空斑)。间接法是在脾细胞(约免疫l0d后),SRBC和补体反应系统中再加入高度特异性的抗Ig类血清,例如要检测IgG抗体生成细胞则要加入抗鼠IgG抗血清,其余操作均同直接法。本试验仅介绍直接法。

材料

1.20%SRBC悬液(用Hanks液配制)。

2.补体 新鲜豚鼠血清(用前经靶细胞吸收,l ml压积SRBC加20ml补体,充分混匀,而后置4℃20min吸收,离心1000rpm,10min,取上清,用Hanks液稀释为l∶10)。

3.右旋糖酐(DEAE-dextran,分子量50万,用蒸馏水配制成l0mg/m1,阻止琼脂的抗补体作用)。

4.琼脂或琼脂糖(表层基0.7%,底层基1.4%用Hanks配制)。

5.胎牛血清(56℃30min灭活,并经羊红细胞吸收)。

6.Hanks液。

7.水浴箱调至47~49℃。

8www.med126.com.1ml注射器和青霉素小瓶。

9.玻璃平皿(7×1.5cm)。

10.动物  体重18~25g的纯系小鼠。

11.0.5%台盼蓝染液。

12.其他器材 剪刀、镊子、解剖板、血球计数板、注射器、纱布、试管等。

方法

1.将溶化的底层琼脂倾注平皿内,成一薄层,待凝固备用。

2.将每管含2ml表层基的试管加热融化后,放47~49℃水浴保温。

3.SRBC悬液的制备

以无菌操作抽取绵羊血。保存于阿氏(Alsevers)液内,置4℃保存,一般不超过2周。实验时取保存的羊血,用生理盐水洗涤三次,每次离心2000rpm,5min,制成SRBC悬液,计数,然后按实验需要配制成20%及2×109/ml的红细胞悬液。

4.免疫小鼠脾细胞悬液的制备

⑴ SRBC免疫小鼠  最好用纯系鼠,体重25g左右,腹腔注射绵羊红细胞(2×109个/m1)0.5ml或尾静脉注射0.2ml。测定直接溶血空斑,用免疫后4d的鼠;测定间接溶血空斑,用免疫后10d的鼠。

⑵ 将免疫小鼠拉脱颈椎致死。暴露腹腔,取出脾脏放在周围有碎冰块的小瓶内,先用1ml注射器尖端将其捣碎,再加冷Hanks液数毫升,用注射器抽吸吹打,使细胞分散均匀。经尼龙布(或八层纱布)过滤离心去上清,将细胞用冷Hanks液洗涤两次,再将沉淀的细胞重悬于1ml冷Hanks液内,置冰浴中。

⑶ 脾细胞用白细胞计数法计数并用台盼蓝检查活细胞的百分率。脾细胞制成5~10×107细胞/ml;另取少量脾细胞悬液与等量0.5%台盼蓝混匀,静置数分钟,计数核被染色死细胞的百分数,从总细胞数中将死细胞数扣除。

 5.试验平皿的制备   将底层平皿和所有试剂(除脾细胞外)预温40℃左右。于水浴内保温之表层基中加入以下各试剂:⑴胎牛血清0.1ml;⑵右旋糖酐(10mg/m1)0.1ml(用琼脂糖时不用此试剂);⑶20%SRBC悬液0.1ml;⑷脾细胞悬液(5~l0×106细胞/m1)0.1ml。迅速将小试管夹于两手掌间旋转混匀,倾注于铺有底层之平皿内,避免倾入气泡。在水平台上使表层基铺平,凝固后,放37℃孵育1h。然后于每个平皿内加1∶l0稀释的补体1.5~2ml,使均匀覆盖其表面,再次孵育30min,即可用肉眼或放大镜观察溶血空斑,并计数。

   【结果】  

将平皿划分小格,用放大镜观察并计数溶血空斑总数,再换算出每百万脾细胞中所含抗体形成细胞数。如用于药物筛选,可比较给药组和对照组每百万脾细胞(1×106)中抗体形成细胞数的平均值,以表示药物的刺激作用或抑制作用。

注意事项

1.绵羊红细胞最好用新鲜脱纤维的SRBC。洗涤SRBC时,离心速度以2000rpm,10min为宜,不超过三次。用前镜检如有变形,表示脆性增大,不宜采用。

2.SRBC可大致计数,但脾细胞计数必须准确。

3.免疫动物必须用纯系动物,杂种动物个体差异大,难以比较。最好先作几次预试验,使每个平皿空斑数控制在100~150个左右为宜。

4.补体浓度以l∶10为宜,无需经过滴定。但若用琼脂铺板时则补体原液不必稀释,以阻止琼脂的抗补体作用。

5.所有器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温,并在水平台上操作。

6.离体的脾细胞应不离冰浴,防止细胞死亡。

思考题

1.简述溶血空斑试验的原理及其实际应用。

2.在本试验中,绵羊红细胞有什么作用? 

实验四  生物制品

用于人工免疫的抗原、免疫血清、免疫细胞和免疫分子制剂,以及诊断用的生物制剂统称为生物制品(biologic product)。生物制品主要分为三类,即预防接种制品、治疗制品和诊断用品。

一、预防接种制品

   国内常将由细菌、螺旋体制备的用于人工自动免疫的生物制品称为菌苗,而将由病毒、立克次体等制备的用于人工自动免疫的生物制品称为疫苗。国际上常将其统称为疫苗。

(一) 菌苗类

1.死菌苗  霍乱菌苗、伤寒菌苗,伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗,霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙四联菌苗,百日咳菌苗等。

2.活菌苗  卡介苗(BCG)、鼠疫活菌苗。

  (二)疫苗类

1.死疫苗  流行性乙型脑炎鼠脑疫苗、鸡胚疫苗、组织培养疫苗、斑疹伤寒鼠肺疫苗。

2.活疫苗  脊髓灰质炎减毒活疫苗。

3.类毒素类

由细菌外毒素制备的人工自动免疫制品称为类毒素,如白喉类毒素、精制磷酸铝吸附白喉类毒素、伤风类毒素、精制磷酸铝吸附破伤风类毒素等。

4.混合制品类

百日咳菌苗和白喉类毒素混合制品,百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制品。

二、治疗制品

  (一)抗毒素

用类毒素免疫动物获得的人工被动免疫制品称为抗毒素。如精制白喉抗毒素、精制破伤风抗毒素、干燥粉剂破伤风抗毒素。

  (二)其它免疫血清制品

胎盘球蛋白、丙种球蛋白、抗麻疹人血清、抗淋巴细胞血清(anti-lymphocyteserum, ALS)、 抗淋巴细胞丙种球蛋白(anti-lymphocyte γ globulin, ALG)等。

  (三)免疫细胞和免疫分子制剂

转移因子(transfer factor,TF)、免疫核糖核酸(immune RNA,iRNA)、胸腺素(thymosin)等。

三、诊断用品

  (一)旧结核菌素(old tuberculin,OT)和精制结核蛋白衍生物(purified protein der中国卫生人才网ivative,PPD)。

  (二)锡克氏毒素(Schick’s toxin)、狄克氏毒素(Dick’s toxin)。

  (三)诊断菌液  变形杆菌OX19、OXK 等菌液。

  (四)诊断血清  沙门氏菌属因子血清,志贺氏菌属因子血清,甲胎蛋白诊断血清,羊抗人IgG、IgA、IgM诊断血清等。

思考题

1.常用于预防接种和免疫治疗的生物制品有哪些?其应用原理与原则如何?

2.什么是人工主动免疫和人工被动免疫?

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