实验八 血痕的DNA提取及STR分析
熟悉掌握Chelex法提取血痕DNA的方法，掌握PCR反应的原理和方法，以及STR分析方法；了解血痕DNA提取的常见方法。
【实验内容】
一、 血痕DNA提取
在DNA分析技术运用于实际检案的过程中，血痕是最常见的检材之一。对血痕提取DNA，再进行PCR扩增特定基因位点，然后电泳显色检测，这是常用的法医物证检验方法。目前，用于提取血痕DNA的方法很多，不同的方法有不同的优缺点，其适用的分析技术也不同。而且，法医检案的实际应用过程中经常遇。所以，在血痕DNA提取方面，我们应该了解多一点的方见不少问题，比如：微量血痕的DNA提取，血痕中含有过量的杂质等等法。因此，本次试验介绍以下几种常用的血痕DNA提取的方法，供同学们学习。分别是：Chelex-100法、酚－氯仿法、碱性裂解法、以及这些方法的改良。
﹙一﹚ Chelex-100法
1. 原理
细胞中的DNA一般与蛋白质结合，提取DNA的过程就是破碎细胞，去除与DNA结合的蛋白质、多糖、脂类﹙也包括去除其他核酸﹚，最后分离、纯化所需的DNA过程。在DNA的提取方法中，我们需用到蛋白酶K、SDS。蛋白酶K的作用是消化与DNA结合的蛋白质，释放DNA。SDS的作用是破坏细胞膜、核膜，并使组蛋白等从DNA分子上解联。Chelex-100法中, chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物，对多价金属离子有鳌和作用，可防止DNA在煮沸加热时被降解，同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。这样既可减少DNA的损失，又可消除扩增中的一些抑制因素，因此血痕DNA采用chelex-100法，由于其快速、实用而被广大法医物证工作者所用。
2. 仪器设备与试剂
(1) 仪器设备
离心机、进样器、1.5mlEppendorf离心管、水浴锅、振荡器。
(2) 试剂
灭菌去离子水，chelex-100
3. 方法
（1) 检材用量：对于大量血痕﹙如血纱布﹚，剪取约1×1cm2大小，不可过多否则会抑制PCR反应。如果血痕属微量血痕，可直接用进样器吸取20－40ul灭菌去离子水，然后在血痕处反复吹打，将血痕尽可能的洗下来并装入离心管中。
（2) 取适量血痕检材置1.5mlEP管中，加入1ml灭菌无菌水浸泡20min，10000rpm离心3min，用1000ul进样器小心地吸去上清液。
（3) 加5％chelex-100 200ul，于水浴锅中56℃水浴30min，振荡混匀。
（4) 沸水中煮10min，取出后立即置于冰上3min，10000rpm离心1min。上清液即为DNA提取液，可在2－6℃保存1个月，在－20℃长期保存。
【注意事项】
对www.med126.com/hushi/部分陈旧、或污染有多量泥沙、载体吸附力强或色素深的血痕检材，经一次chelex-100的处理，仍不能扩增成功，这可能是由于以下几个原因：
a) 血痕过于陈旧，血色素无法溶解下来，使血色素对扩增的抑制增强，导致扩增失败。
b) 血痕受泥沙或载体色素的影响，使扩增受到抑制。
c) 血痕载体吸附力强，导致DNA提取率降低。
d) 血痕量太少，超出检验灵敏度。
针对以上几种影响因素，进行一些改良处理：
a) 对难于溶解的陈旧血痕，可加入1／10体积的10％SDS，促进血色素的溶解，易于洗涤，减少血色素对扩增的抑制。
b) 对受泥沙或载体色素影响的血痕，可对首次DNA提取液进行二次提取，使模板被稀释，减少载体的干扰，进一步去除模板中的扩增抑制物。
c) 对载体吸附能力强的血痕，可增加浸泡时间，同时也可结合上述方法。
d) 对于量少而受污染的血痕，经上述处理后，再经超滤柱浓缩，使模板DNA浓度达到可检测范围。在检案过程中，检材经常是受多种因素的影响，因此可综合利用上述几种处理方法。
﹙二﹚ 酚－氯仿法
1. 原理：
本试验采取酚、氯仿反复抽提，是与DNA结合的蛋白质解离、去除。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。酚起萃取作用。试验中还要用到异戊醇，有助于消除抽提过程中出现的泡沫。
2. 仪器设备与试剂
(1) 仪器设备：
水浴锅、振荡器、离心机、进样器、1.5mlEP管
(2) 试剂：
灭菌去离子水、STE﹙氯化钠、Tr执业兽医is、EDTA﹚缓冲液、蛋白酶K、10％SDS、苯酚／氯仿／异戊醇混合物﹙25：24：1﹚、氯仿／异戊醇混合物﹙24：1﹚、5mol/L氯化钠、70％乙醇
3. 方法：
（1) 取适量血痕检材置于1.5ml EP管中，加入1ul无菌水浸泡20min，>10000rpm离心3min，弃去上清。
（2) 加入500ul STE液悬浮沉淀物，加入20ul10％SDS及10mg/ml蛋白酶K4ul，54℃水浴消化3h。
（3) 离心取上清液至另一EP管中，加入500ul苯酚／氯仿／异戊醇混合物，振荡到出现絮状物，>10000rpm离心3min。
（4) 转移上层水相至另一EP管中，加入／氯仿／异戊醇混合物，振荡，>10000rpm离心3min。
（5) 取上层水相，加入30ul 5mol/L氯化钠和1ul冰无水乙醇，振荡，10000rpm离心3min，去除乙醇。
（6) 取絮状物加入500ul 70%乙醇，振荡，＞10000rpm离心3min。
（7) 弃去上清液，加入无菌水100uL使其溶解，4℃保存备用。
【注意事项】
酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一，无论是血液还是血痕标本均适用，所提取的DNA纯度高，可满足各种分子生物学检测技术的需要，但该法操作较为繁琐、耗时长，影响了其在实践工作中的广泛应用。
（三)碱性裂解法
1. 原理：
碱性裂解法是指在强碱作用下，使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸、天冬氨酸、氨酸残基等迅速发生电离，从而快速破坏蛋白质的一级结构。正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用，所以，检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞膜及核膜，使核酸酶变性及DNA释放。此时，DNA的一级结构是相对完整的。这个原理在细菌质粒DNA提取中运用较多。
2. 仪器设备与试剂：
(1) 仪器设备：
0.5ml EP管、水浴锅、离心机
(2) 试剂：
裂解液 0.2mol/LNaOH溶液（国产分析纯)。
中和液 0.04mmol/LTris-HCL（PH 7.5)进口分装。
3. 方法：
（1) 取适量血痕于0.5mlEP管中，加入20ul0.2mol/LNOH溶液，80℃保温5min（若为陈旧血痕，可适当增加保温时间5-10min)。
（2) 加入180ul0.04mmol/L Tris-HCL（pH7.5)。离心，4℃保存备用。
【注意事项】
血痕要求在75~80℃之间保温5min，若检材为陈旧性，尚应适当延长保温时间5~10min。碱性裂解法提取生物检材DNA只需一个离心管，一次完成DNA的提取，虽然不能提取100%纯度的DNA，但极大地避免了常规方法反复提纯必然导致的DNA在量上的损失。因此，本方法对微量检材DNA的提取有着更广泛的应用前景。
与Chelex-100提取法相比较，碱性裂解法有以下特点：耗时少，碱性裂解法提取检材一般需5min。碱性裂解法提取DNA所耗检材少，灵敏度高。碱性裂解法所需仪器及设备只是一个0.5ml小离心管，试剂只是NaOH及Tris-HCl等，这些均是普通实验室常规材料及试剂，大大节约了资金，减少了对国外试剂及仪器的依赖。同时既适合普通的银染检测，又适用于自动DNA片段分析仪进行片段分析。由于所用试剂中含有强碱，可以有效抑制Taq酶抑制剂的作用，所以对于相同的位点，可以取得跟Chelex-100相似的扩增效果。
（四)改良方法
将Chelex-100法或碱性裂解法处理的血痕，用等体积的饱和酚-氯仿（1:1)处理一次，再用冰无水乙醇沉淀，挥干后，加适量无菌水溶解。这样提取的DNA，经过PCR扩增电泳后，显示结果会更好。
二、STR基因座的PCR扩增及电泳检测
方法同实验二
【注意事项】
对于微量血痕的DNA样本，往往需要在扩增反应体系中加入更多的DNA模板，以提高扩增成功率。有时，可能需要进行多次扩增方能成功。
