| 公开(公告)号 | CN1291037C |
| 公开(公告)日 | 2006.12.20 |
| 申请(专利)号 | CN200410016012.X |
| 申请日期 | 2004.01.19 |
| 专利名称 | 一种芯片原位聚合酶链反应检测目标基因的方法 |
| 主分类号 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分类号 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 |
| 发明(设计)人 | 赵建龙;高秀丽;杨剑波;景奉香 |
| 地址 | 200050上海市长宁区长宁路865号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 上海智信专利代理有限公司 |
| 代理人 | 潘振甦 |
| 国省代码 | 上海;31 |
| 主权项 | 一种利用原位PCR检测芯片检测目标基因的方法，其特征在于检测的具体步骤是：(1)引物设计：遵循各个引物的退火温度Tm值大致相同的原则，用Primer5.0软件设计引物，序列如下┏━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━┓┃ 引物名称┃ 上游引物 ┃ 下游引物 ┃ 产物长度┃┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━┫┃ GUS ┃ 5′-聚(T)16GGT CAG TGG CAG TGA ┃ 5′-AGC GTC GCA GAA CAT ┃ 539bp ┃┃ ┃ AGG G-3′Tm＝58.1 ┃ TAC AT -3′ ┃ ┃┃ ┃ ┃ Tm＝55.8 ┃ ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━┫┃ 35S ┃ 5′-聚(T)16TGG AAA AGG AAG GTG ┃ 5′-ATA GTG GGA TTG TGC ┃ 209bp ┃┃ ┃ GCTC-3′Tm＝57.3 ┃ GTC AT-3′ ┃ ┃┃ ┃ ┃ Tm＝55 ┃ ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━┫┃ HptII ┃ 5′-聚(T)16GAT GTT GGC GAC CTC ┃ 5′-TCG TTA TGT TTA TCG ┃ 517bp ┃┃ ┃ GTA TT-3′Tm＝57.5 ┃ GCA CTT T-3′ ┃ ┃┃ ┃ ┃ Tm＝57.4 ┃ ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━┫┃ AadA ┃ 5′-聚(T)16GTT GCT GTC TCC CAG ┃ 5′-CCT TTG CTC GGA AGA ┃ 298bp ┃┃ ┃ GTC GG-3′Tm＝62.5 ┃ GTA TGAA -3′ ┃ ┃┃ ┃ ┃ Tm＝59.1 ┃ ┃┗━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━┛(2)芯片的制备：上游引物5’端氨基修饰且连有16个碱基长的多聚T的臂结构，将上游引物用去离子水溶解并与点样缓冲液等体积混合，通过Cartesian microarray制作系统点阵于醛基修饰载玻片表面，室温下固定72h；(3)芯片上的原位PCR反应：PCR扩增体系如下┏━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┓┃ 试剂 ┃ 每份用量 ┃┣━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━┫┃ 10×buffer ┃ 1.5ul ┃┃ 浓度为2.5mM的dNTP ┃ 1.2ul ┃┃ dig-dUTP ┃ 0.5ul ┃┃ 浓度为15ng/ul的模版 ┃ 1.5ul ┃┃ 浓度为10pmol/ul的反向引物 ┃ 1ul×4 ┃┃ 浓度为1U/ul的Taq ┃ 1ul ┃┃ H2O ┃ 5.3ul ┃┃ 总体积 ┃ 15ul ┃┗━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┛取PCR混合液50ul滴于芯片方阵上，然后用盖片封片，置于PCR仪上采用如下程序进行循环：94℃预变性4分钟，94℃变性1分钟-58℃退火1分钟-72℃延伸30秒，共10个循环，最后72℃延伸5分钟；(4)芯片的洗脱及显色PCR结束后，去除盖片后置于0.1×SSC0.1％SDS洗液I中室温摇洗10-30分钟，然后在含有100mM顺丁烯二酸、150mM NaCl PH7.5、0.3v/v％吐温20的洗液II中摇洗5分钟，吸干洗液后于方阵上滴加15-20ul抗体，盖上盖玻片后避光室温反应30分钟；最后经洗液II、检测缓冲液冲洗、吸干后，滴加显色液并盖膜使其显色于膜上，室温避光显色30分钟-2小时。 |
| 摘要 | 一种利用基因芯片的检测方法，是在芯片表面进行原位PCR反应对待测基因进行检测的方法。将普通PCR反应中的上游引物连接poly(T)的臂结构后，5’端氨基修饰后连接于醛基修饰的玻片等载体上，在芯片表面上进行的一种芯片原位PCR反应。利用本发明能有效解决目前基因芯片杂交中小片断探针和待测大片段不能有效杂交的问题，实现了样品处理和标记同步化和原位检测。本发明可用于SNP检测、转基因植物检测、疾病检测等方面。 |
| 国际公布 |
