实验九 球菌
球菌种类繁多，广泛分布于自然界和正常机体，大多为非致病性球菌；少数为致病性球菌，主要引起人体化脓性感染。根据革兰染色性不同，分为革兰阳性球菌和革兰阴性球菌两类，其中革兰阳性球菌有葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌等；革兰阴性球菌有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。
一、葡萄球菌属
葡萄球菌属(Staphylococcus)为革兰阳性球菌，呈葡萄串状排列，无鞭毛、无芽胞、某些菌株有荚膜。营养要求不高，需氧或兼性厌氧。根据其细胞壁组成、血浆凝固酶及毒素产生以及致病性不同分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌是主要的致病性葡萄球菌，能产生金黄色色素、血浆凝固酶、溶血毒素，能分解甘露醇，某些菌株还能合成肠毒素。在临床上主要引起化脓性炎症、败血症或食物中毒。
（一)形态与培养特性
【材料与方法】
1．取金黄色、表皮、腐生葡萄球菌各接种一个血平板，37℃培养18～24h，观察其菌落特点。
2．金黄色、表皮葡萄球菌琼脂斜面18～24h培养物，革兰染色，镜检。
【结果】
1．血平板上的菌落：金黄色、表皮、腐生葡萄球菌菌落均为圆形、湿润、光滑、边缘整齐的菌落，各自形成金黄色、白色、柠檬色脂溶性色素，金黄色葡萄球菌常形成透明的完全溶血环(β-溶血环)。
2．革兰染色片镜检：可见到呈葡萄串状聚集的革兰阳性球菌。
（二)血浆凝固酶试验
血浆凝固酶是致病性葡萄球菌的主要特征，大多数金黄色葡萄球菌能产生此酶。分游离型凝固酶和结合型凝固酶两种。游离型凝固酶在有凝固酶反应因子存在的条件下，可使纤维蛋白原变成纤维蛋白，导致血浆凝固，常用试管法检测。结合型凝固酶存在于菌体表面，为纤维蛋白原受体，可与纤维蛋白交联而使细菌凝聚，常用玻片法检测。
1．玻片法
【材料】
(1) 金黄色、表皮葡萄球菌琼脂斜面18～24h培养物。
(2) 兔(或人)血浆、生理盐水。
(3) 毛细吸管、玻片、接种环等。
【方法】
(1) 将玻片划分成3格，用毛细吸管在第3格中加1滴生理盐水，第1及第2格中加1滴兔(或人)血浆。
(2) 从琼脂斜面挑取金黄色葡萄球菌，分别混悬于第3格和第1格内，第2格中混悬表皮葡萄球菌，静置片刻，观察结果。
【结果】
第3格和第2格不凝集；第1格中金黄色葡萄球菌凝集成块，即判定为血浆凝固酶阳性。
2．试管法
【材料】
(1) 金黄色、表皮葡萄球菌琼脂斜面18～24h培养物。
(2) 兔(或人)血浆、生理盐水。
(3) 1ml刻度吸管，小试管。
【方法】
(1) 用刻度吸管，将生理盐水与兔血浆1∶4稀释，然后分别取0.5ml加入2支小试管内。
(2) 从斜面上分别挑取金黄葡萄球菌和表皮葡萄球菌各数环于血浆管内，制成细菌悬液。置37℃水浴30min，观察结果。
【结果】
接种金黄色葡萄球菌管中血浆凝固，接种白色葡萄球菌管中血浆不凝固，前者为凝固酶试验阳性。
二、链球菌属
链球菌属(Streptococcus)是革兰阳性球菌，成双或成链排列。无芽胞，无鞭毛，幼龄菌株具有由透明质酸形成的荚膜，有些菌株有菌毛。为需氧或兼性厌氧菌，营养要求较高，在液体培养基中易形成长链而呈沉淀生长方式。根据不同菌株在血平板上的溶血能力，将链球菌分为甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型链球菌。
（一)形态与培养特性
【材料与方法】
(1) 取甲、乙、丙型3种链球菌的血琼脂斜面18～24h培养物分别涂片，作革兰染色，镜检。
(2) 取上述3种链球菌，以划线接种法分别接种于血琼脂平板上，置37℃培养18～24h，观察结果。
【结果】
(1) 革兰染色片镜检：可见到呈链状排列，长短不一的革兰阳性球菌。
(2) 血平板上的菌落：甲型溶血性链球菌形成草绿色溶血现象，乙型溶血性链球菌形成透明的完全溶血现象，丙型链球菌无溶血现象。
（二)抗链球菌溶血素“O”试验
【原理】
A族链球菌产生的溶血素“O”为蛋白质，具有很强的免疫原性，多数人感染该菌后，血清中出现较高水平的抗“O”抗体，并可至病愈后数月至数年才消失。因此，测定患者血清中抗O抗体的效价，可以作为其感染性疾病(如风湿热及急性肾小球肾炎)的辅助诊断。
本实验是在受检标本中加入适量的溶血素“O”。如标本中含有高浓度抗体，中和后则有多余抗体存在，经与溶血素“O”致敏的胶乳试剂反应，即可发生肉眼可见的凝集。抗“O”试验的效价是指完全不凝集的血清最大稀释度。一般正常人其效价在500u内，大于500u有诊断意义。
【材料】
(1) 病人血清、生理盐水。
(2) 诊断试剂盒
R1 溶血素“O”溶液
R2 ASO胶乳试剂
R3 阳性对照血清
R4 阴性对照血清
【方法】
(1) 将血清标本用生理盐水作1∶50稀释。
(2) 取稀释样本、阴阳性对照各1滴(约50μl)，分别加入溶血素“O”溶液1滴，于黑色背景反应孔内，混匀摇动2min。
(3) 加ASO胶乳试剂1滴混匀，轻轻摇动，5min内(室温18～25℃)观察结果。
【结果判断】
规定时间内出现凝集者为阳性，不出现凝集者(ASO≤250u/ml)为阴性。必要时阳性标本可进一步作1∶80或1∶100稀释，重复操作步骤2和3。
其稀释度与ASO滴度大致关系为：
血清稀释度ASO滴度
1∶50≥500
1∶80 ≥800
1∶100 ≥1000
三、肺炎链球菌
肺炎链球菌(S. pneumoniae)，俗称肺炎球菌(pneumococcus)，菌体呈矛头状，成双排列，尖端向外，革兰阳性球菌。无芽胞，无鞭毛，有明显的多糖荚膜。在固体培养基上由于产生自溶酶而形成“肚脐”一样特殊菌落。能分解菊糖产酸不产气。对胆汁或胆盐和Optochin敏感。
（一)形态与培养特性
【材料与方法】
1．取肺炎球菌接种于血平板上，37℃培养18～24h，观察其菌落特点。
2．肺炎球菌血琼脂平板18～24医学招聘网h培养物，革兰染色，镜检。
【结果】
１．菌落圆形，光滑，中间凹陷，边缘隆起，带粘性。菌落周围有草绿色溶血环。
２．肺炎球菌呈矛头状，成双排列，尖端向外，具有肥厚的荚膜，革兰阳性菌。
（二)Optochin敏感试验
Op医学全.在线tochin即乙基氢化羟基奎宁，水溶液比较稳定，可冷藏数周，亦可高压蒸气灭菌。几乎所有肺炎球菌都对Optochin敏感，而甲型链球菌则不敏感，故此试验可鉴别这两种细菌。
【材料与方法】
1．将肺炎球菌和甲型链球菌分别涂布接种血琼脂平板各1个。
2．把直径6mm的滤纸片放人l∶4000 Optochin水溶液中，浸湿后分别贴于涂有菌的平板上，37℃培养18h，观察结果。
【结果】
肺炎球菌平板的滤纸片周围可见直径大于20mm的抑菌圈，链球菌则无或直径小于l0mm的抑菌圈。
四、奈瑟菌属
奈瑟菌属(Neisseria)为革兰阴性双球菌，无鞭毛，无芽胞，有菌毛。对人体致病的有脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎球菌)、淋病奈瑟菌(淋球菌)。
（一)形态与培养特性
【材料与方法】
1．观察脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌革兰染色片，注意细菌的形态、排列及染色性。
2．取急性病人的脓性分泌物标本，直接涂片，革兰染色，镜检。
【结果】
1．脑膜炎奈瑟菌菌体呈肾形，成双排列，凹面相对，革兰阴性菌；淋病奈瑟菌呈咖啡豆形，成双排列，革兰阴性菌。
2．可见在中性粒细胞内外，有革兰阴性双球菌。
（二)脑脊液直接涂片检查
【材料与方法】
1．将新鲜脑脊液标本，于3000rpm离心30min。
2．去上清液，取沉淀涂片，革兰染色，镜检。
【结果】
若发现肾形、成双排列的革兰阴性球菌，并多数位于中性粒细胞内者，多为脑膜炎奈瑟菌。
