| 实验一 蛋白质含量的测定 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
目前，蛋白质含量的测定方法有两大类：一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率、比重、染料结合、紫外吸收等进行测定；另一类是利用化学方法来测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮法、双缩脲法和Folin-酚试剂法（Lowry法)。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，主要根据实验要求及实验室条件进行选择（表2-1)。 表2-1 几种测定蛋白质含量的方法比较
【实验目的】 本实验要求掌握几种常用的测定蛋白质含量的原理和方法；了解这几种测定方法的区别及各自的应用。 （一)双缩脲法 【实验原理】 双缩脲（biuret)（H2N－CO－NH－CO－NH2)在碱性溶液中能与铜离子（Cu2+)结合生成复杂的紫红色络合物。蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质含量的测定。生成的紫红色络合物分子结构为： 实际上，凡分子内含有两个氨甲酰基（－CO－NH2)的化合物，不论是直接相连或是通过一个氮或碳原子间接连接；以及具有一CS－NH2，一C(NH)NH2，－CRH－NH2，－CH2NH－CHNH2CH2OH，－CHOH－CH2NH2等基团的化合物均能产生双缩脲反应；甚至过量的铵盐也会干扰反应。所以，双缩脲反应并非为蛋白质所特有。 【实验试剂和器材】 1．试剂 ⑴ 10% NaOH溶液。 ⑵ 双缩脲试剂：称取硫酸铜（cupric sulfate，CuSO4•5H2O，A.R.或C.P.)1.50 g，酒石酸钾钠（potassium sodium tartrate，NaKC4H4O6•4H2O，A.R.或C.P.)6.0 g，分别用蒸馏水约250 mL溶解后，全部转移于1 L容量瓶中，混合；再加入10% NaOH溶液300 mL，随加随摇匀；最后用蒸馏水稀释至1 L，保存于塑料试剂瓶中。如无红色或黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。 ⑶ 标准血清：收集足量的新鲜血清（单份的或混合的)，每100 mL加入叠氮钠50 mg，置于冰箱内分装后冰冻保存。 ⑷ 生理盐水，即0.9%的NaCl溶液。 2．器材 ⑴ 试管及试管架。 ⑵ 刻度吸量管。 ⑶ 722型分光光度计。 【实验步骤】 将血清标本及标准血清用生理盐水作1/20稀释（例如血清0.20 mL加生理盐水3.80 mL)，然后按下表操作：
充分混和，室温放置30分钟。以空白管调零，在波长540nm处读取各管光密度值。 标准血清蛋白浓度 = 65g/L (即每1000mL血清含65g蛋白质)。 计算：
【实验注意事项】 1．本法完全适用于血清（浆)总蛋白的测定。 2．本法显色很稳定，在相同的实验条件下进行的测定中，标准管的光密度基本一致。 3．本显色反应刚开始后数分钟，颜色逐渐加深，温度较高时增色较快，但到30分钟时，各种温度下（20~40℃)显色均已达到顶点，因此显色时温度无须恒定。 4．体液中除蛋白质外，不能含有与双缩脲试剂显色的物质。 （二) BCA法 【实验原理】 BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其它试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。 【实验试剂和器材】 1. 试剂 ⑴ 试剂A：1％BCA二钠盐；2％无水碳酸钠；0.16%酒石酸钠；0.4％氢氧化钠；0.95％碳酸氢钠。混合调pH值至11.25。 ⑵ 试剂B：4％硫酸铜。 ⑶ BCA工作液：试剂A 100 mL＋ 试剂B 2 mL混合。 ⑷ 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5 mg/mL的蛋白质标准液（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。 ⑸ 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。 2. 器材 ⑴ 722型分光光度计。 ⑵ 恒温水浴箱。 ⑶ 中试管7支。 ⑷ 移液器。 【实验步骤】 1. 操作 取试管七支、编号，按下表操作：
混匀，37℃保温30min，用562nm比色，测定光密度值。 2. 计算 ⑴ 绘制标准曲线。 ⑵ 以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 ⑶ 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 【实验注意事项】 1. 该测定方法操作简单，快速，45分钟内完成测定。 2. 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20~200μg/mL，微量BCA测定范围在0.5~10 μg/mL。 3. 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量。 5. 此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。 （三)考马斯亮蓝G-250法 【实验原理】 考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue)G-250存在两种不同的颜色形式，红色和蓝色，能与蛋白质通过范德华氏引力而结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质与染料的结合成正比，故可用于蛋白质含量的测定。此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变为蓝色，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知其结合蛋白质的量。 蛋白质与染料的结合反应很快，约2分钟即可完成达最大光吸收，并可稳定约1小时，之后发生聚合并沉淀。此法测定蛋白质含量的灵敏度很高，比Lowry法灵敏4倍，测定范围在10~250μg蛋白质。显色反应重复性好，精确度高，线性关系好，干扰物少，但大量去污剂存在时对显色反应影响太大且不易消除。 【实验试剂和器材】 1．试剂 ⑴ 考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue)G-250 100 mg溶于95%乙醇50 mL中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V)考马斯亮蓝G-250，4.75%（V/V)乙醇，8.5%（V/V)磷酸。 ⑵ 标准蛋白溶液：准确称取一定量经干燥恒重的结晶牛血清白蛋白，用生理盐水配制成0.1 mg/mL蛋白溶液。 ⑶ 0.9% NaCl（生理盐水)。 2．器材 ⑴ 试管及试管架。 ⑵ 刻度吸量管。 ⑶ 722型分光光度计。 【实验步骤】 测定血清样品蛋白质的含量时，先取血清0.1mL置于50mL容量瓶中，再加0.9%NaCl至刻度，混匀，此为稀释500倍待测标本。 取试管3支，按下表操作：
混匀各管，5分钟后，以空白管调零，在波长595nm处测定各管光密度值。 计算：
【实验注意事项】 1．微量测定时，可将取样量和试剂量减至20%量进行测定。 2．如果测定要求严格，可在显色后5~20min内进行测定，此段时间颜色最稳定。 3．测定中，会有少量蛋白-染料复合物吸附于比色杯壁上，此吸附量可以忽略，测定完毕后可用乙醇将比色杯清洗干净。 4. 强碱缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。 （四)紫外分光光度法 【实验原理】 蛋白质分子组成中常含有色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，故可用280nm波长的光密度大小来测定一般蛋白质的含量。测定范围为20~100μg/mL。 由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260卫生资格考试网nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此，溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm的光密度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质含量。此外，乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长处有较大的光吸收，不能应用。 此法测定蛋白质含量的优点是简便、迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因而在生物化学实验中广泛应用。此法的缺点是当样品蛋白质中色氨酸和酪氨酸残基的组成与标准蛋白质的组成相差较大时，测定结果有一定的误差；当样品中存在核酸等紫外吸收物质时，也会出现较大的干扰。 【实验试剂和器材】 1．试剂 ⑴ 生理盐水。 ⑵ 血清。 2．器材 ⑴ 试管和吸量管。 ⑵ 容量瓶（50mL)。 ⑶ 752型紫外-可见分光光度计。 【实验步骤】 1．稀释血清（或其他蛋白质溶液)：准确吸取0.1mL血清置于50mL容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（即稀释500倍)。 2．测定光密度：在紫外分光光度计上，将稀释的蛋白质溶液小心盛于石英比色杯中，以生理盐水为对照，测得280nm及260nm两种波长的光密度值。 计算： 将280nm及260nm波长处测得的光密度值按下列校正经验式计算蛋白质浓度： 蛋白质浓度(mg/mL)= (1.45A280— 0.74A260)×500 【实验注意事项】 1．不同的蛋白质及核酸的光吸收率不是恒定不变的，所以可能产生误差。另一方面像嘌呤碱、嘧啶碱一类物质在波长260nm和280nm处也有光吸收。因此，样品中核酸含量必须在20%以下，A280/A260＞1.5时方可用上述公式计算蛋白质含量。 2．本法对微量蛋白的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定则往往比较困难。 3．如为纯蛋白质样品，可根据蛋白质在280nm附近的标准吸光系数，直接测定该蛋白质的含量。如牛血清蛋白的
（式中A280为280nm波长处测得的光密度值)。 4．为简便起见，对于混合蛋白质溶液，可用A280乘以0.75来代表其中蛋白质的大致含量（mg/mL)。 【思考题】 1. 以上几种测定蛋白质的方法有何区别与意义？ 2. 除以上方法外，其他还有什么方法测定蛋白质的含量? 3. 各种测定蛋白质方法的原理是什么? 4. 紫外与可见光分光光度法有哪些相同点和不同点?
|
.gif){kind=small}
为6.3，则待测样品中牛血清蛋白含量可用下式计算：